Предупреждение о реконструкции страницы ...поэтому отнеситесь к недоработкам с пониманием и терпением, пожалуйста!

Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ

Программные требования по разделу "Молекулярные основы наследственности" посмотреть.

 

ВВЕДЕНИЕ

Клетки и состоящие из них организмы поддерживают высокую упорядоченность своей организации благодаря имеющейся у них генетической информации. Эта информация воспроизводится, сохраняется, реализуется и иногда даже совершенствуется благодаря четырём генетическим процессам: 1) репликации ДНК, 2) репарации ДНК, 3) синтезу белка и 4) генетической рекомбинации. Первые три процесса будут рассмотрены в этом разделе. Генетическая рекомбинация рассматривается в разделах «Мейоз», «Сцепление генов и кроссинговер» и «Мутационная изменчивость».

2.1. Строение нуклеиновых кислот

После утверждения в 20-х годах ХХ в. хромосомной теории наследственности биологи более сорока лет считали, что в нуклеопротеидной структуре хромосом генетическим материалом служат молекулы белка. И лишь исследования 50-60-х гг. прошлого столетия доказали, что на самом деле хранение и передачу наследственной информации осуществляют нуклеиновые кислоты.

2.1.1. История открытия нуклеиновых кислот и доказательство их генетической роли

В 1869 г. швейцарский биохимик Иоганн Фридрих Мишер (рис.) выделил из ядер клеток вещество, которое состояло из кислого и щелочного компонентов белковой природы. Он назвал это вещество нуклеином.

Рис. Мишер Иоганн Фридрих (1844-1895).

В 1889 г. немецкий гистолог Рихард Альтман обозначил кислый компонент нуклеина термином «нуклеиновая кислота». В конце XIX в. немецкий биохимик Альбрехт Коссель (1853-1927) (рис. 2.2) расшифровал химический состав нуклеиновой кислоты, показав, что она содержит фосфорную кислоту, углевод и азотистые основания (пурины и пиримидины). Ф. Левен, Д. Гулланд с сотрудниками (в цикле исследований, проведённых 1900-1932 гг.) установили, что фосфорная кислота, углевод и азотистое основание соединены в блоки в виде мономеров – нуклеотидов, расположенных вдоль линейной молекулы нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, выделенная из ядер клеток, в качестве углевода содержит D-дезоксирибозу. Поэтому она получила название дезоксирибонуклеиновой кислоты – ДНК. Наряду с ядерной была выделена цитоплазматическая нуклеиновая кислота, содержащая в качестве углевода D-рибозу; она получила название рибонуклеиновой кислоты – РНК.

Рис. Коссель Альбрехт. (1853-1927), немецкий биохимик.

А.Н. Белозерский и И.И. Дубровская в 1936 г. выделили ДНК из ростков конского каштана. Это показало, что ДНК входит в состав клеток и животных и растений. ДНК была обнаружена и в клетках бактерий.

Современные взгляды на химическое строение нуклеиновых кислот сформировались в 40-50-х гг. прошедшего века. Американский биохимик Эрвин Чаргафф разработал точные методы определения количества азотистых оснований и установил характерные особенности химического состава нуклеиновых кислот. Это сыграло большую роль в познании молекулярной структуры ДНК.

Впервые прямые доказательства того, что молекулы ДНК являются носителями наследственности, были получены при исследовании у бактерий явления трансформации и позже подтверждены результатами исследования трансдукции. Вкратце эти исследования состояли в следующем.

Явление трансформации у бактерий открыл в 1928 г. английский бактериолог Фредерик Рис Гриффит (1877-1941) в опытах с пневмококками Diplococcus рпеиmoniae. Для эксперимента Ф.Р. Гриффит использовал два разных штамма пневмококов. Бескапсульный невирулентный штамм R (от англ.: rough – шероховатый) растёт на твёрдой питательной среде в виде шероховатых колоний. Бактерии штамма R при введении в организм мышей не вызывают гибели подопытных животных (рис., А). Клетки другого – вирулентного штамма S (от англ.: smooth – гладкий) имеют полисахаридную оболочку (капсулу) и развиваются на питательной среде в виде гладких колоний. Мыши, после заражения этими бактериями, заболевают и гибнут (рис., Б). Если же бактерии штамма S убить нагреванием и уже погибшие бактерии ввести мышам, то мыши не заболевают и, следовательно, не погибают (рис., В).

Рис. Эксперимент Фредерика Гриффита, демонстрирующий явление трансформации (пояснения в тексте) [Вилли К., Детье В., 1974].



Ф. Гриффит убивал клетки S-штамма нагреванием и смешивал их с клетками пневмококков из бескапсульного невирулентного R-штамма. Смесь живых R- и мертвых S-клеток впрыскивал мышам. Так как подопытные мыши не получили живых вирулентных бактерий, можно было ожидать, что они выживут. Однако подопытная партия мышей после опыта погибла (рис., Г). Изучение популяций бактерий, размножавшихся в инфицированных мышах, показало, что часть невирулентных клеток R-штамма превратилась в вирулентные клетки S. Эти факты указывали на то, что при размножении невирулентных R-бактерий какое-то вещество из убитых клеток S-штамма переходило в живые клетки штамма R и направлено трансформировало (изменяло) их генетические свойства. Путем такой трансформации невирулентные клетки бактерий штамма R, лишенные оболочки, превращались в клетки бактерий с оболочкой, которые обладали вирулентными свойствами штамма S.

В 1944 г. химическая природа трансформирующего агента у пневмококков была изучена О. Эйвери, К. Мак-Леодом и М. Мак-Карти. Они установили, что полисахариды из капсулы пневмококков, белки из их клеток, а также рибонуклеиновые кислоты (РНК) трансформирующим эффектом не обладали. И только молекулы ДНК из капсульных бактерий были способны вызвать трансформацию. Трансформирующая способность ДНК была подтверждена специальным экспериментом. Фермент дезоксирибонуклеаза разрушает молекулы ДНК. После обработки ДНК дезоксирибонуклеазой, трансформирующая фракция теряла способность вызывать трансформацию.

Рис. 2.4. Ледерберг Джошуа, американский генетик, профессор Стэнфордского университета. Заложил основы генетики микроорганизмов. Открыл (совместно с Э. Тэйтумом) явление конъюгации у бактерий. Выяснил причины возникновения устойчивости бактерий к антибиотикам. Лауреат нобелевской премии по физиологии и медицине 1958 г.

Некоторое время казалось, что генетическая значимость молекул ДНК ограничивается только единственным случаем трансформации у пневмококков. Но уже в начале 50-х годов ХХ в. были опубликованы результаты экспериментов, неопровержимо доказавших, что у вирусов наследственную информацию также несёт ДНК. Результаты двух очень показательных экспериментов описаны ниже.

Первый из экспериментов был выполнен в 1952 году американскими генетиками Джошуа Ледербергом и Нортоном Циндлером. В своём эксперименте они использовали два разных штамма бактерий Salmonella typhimurium, вызывающих тифоидную лихорадку у мышей.

Бактерии штамма имели мутацию Н, блокирующую синтез гистидина и, поэтому нуждались в нем при культивировании. Штамм 22А имел мутацию Т, блокирующую синтез триптофана. Поэтому бактерии этого штамма нуждались в этой аминокислоте при культивировании. Кроме того, эти бактерии (22А) содержали в себе в лизогенном (т.е. скрытом) состоянии умеренный фаг Р22.

Умеренный бактериофаг Р22 способен инфицировать бактерию Salmonella typhimurium, размножаться в ней, и при этом включать в свою ДНК небольшие фрагменты ДНК бактерии-хозяина. Заражая новые бактерии, вирус может передавать им эти фрагменты ДНК, принадлежащие бактерии, бывшей ранее его хозяином.

Для эксперимента была использована U-образная трубка, которая в нижней части посредине была разделена бактериальным фильтром. Трубку заполнили питательной средой. В одну половину этой трубки были помещены бактерии штамма , а в другую половину трубки – бактерии другого штамма – 22А (рис. 2.5). При этом бактериальные клетки не могли проникать сквозь бактериальный фильтр из одной части трубки в другую.

Рис. 2.5. Схема опыта, демонстрирующего явление трансдукции у сальмонеллы (пояснения в тексте).

После инкубации этих двух разных штаммов в трубке, разделенной бактериальным фильтром, исследователи произвели рассев клеток обоих штаммов. При рассеве клеток штамма 22А на среде, лишенной триптофана, было обнаружено небольшое число колоний. Следовательно, некоторые клетки штамма 22А приобрели способность синтезировать триптофан и смогли развиваться в колонии на среде без этой аминокислоты. Это могло произойти только в том случае, если фаг, вышедший из клеток лизогенного штамма 22А, проник через фильтр, внедрился в некоторые клетки штамма , лизировал их после своего размножения, захватив при этом фрагменты ДНК бактерий с геном, отвечающим за синтез триптофана. Затем вирус инфицировал бактерий штамма 22А и передавал им фрагмент ДНК с триптофановым геном, принадлежавшим ранее штамму .

Следовательно, ДНК фага, проникшего в бактерию штамма , каким-то образом претерпела рекомбинацию с ДНК бактериальной клетки. Благодаря этой рекомбинации в новые фаговые частицы были введены гены бактерии-хозяина. После гибели этой бактерии, сформированные в ней новые фаги, заразили бактерии другого генотипа (22А) и передали ей свою ДНК с новой информацией. Так, клетки штамма 22А приобрели ген, ответственный за синтез триптофана. Это явление переноса генов от бактерии-донора, к реципиенту получило название трансдукции. Оно доказывало, что наследственные свойства обусловлены ДНК, передаваемой от одной бактерии к другой при посредстве бактериофага.

Рис. 2.6. Схема опыта Херши –Чейза, показавшего, что компонентом, ответственным за образование потомства фага Т2 в заражённой фагом клетке, является ДНК фага [Айала Ф., Кайгер Дж., 1988]. Пояснения в тексте.

Второй, очень показательный эксперимент, доказавший, что у бактериофагов генетическая информация также заключена в ДНК, выполнили в том же 1952 году американские вирусологи Альфред Херши и Марта Чейз. Сделано это было следующим образом (рис. 2.6).

В своем опыте А. Херши и М. Чейз пометили белковую часть бактериофага радиоактивным изотопом серы (35S), а ДНК – радиоактивным фосфором (32Р). С помощью электронного микроскопа им удалось выявить, как бактериофаг инфицирует клетки бактерий. Оказалось, что фаг прикрепляется своим отростком к поверхности бактерии, лизирует (растворяет) в этом месте клеточную оболочку и вводит свою ДНК в бактериальную клетку. На поверхности бактерии остается белковая оболочка фага. Такая отделившаяся белковая оболочка получила название тени. Размножение фага в бактериальной клетке идет только благодаря его ДНК. По ее сигналам в клетке бактерии синтезируются белки фага и собираются новые частицы фагов в виде ДНК, одетых защитной белковой оболочкой. Эти опыты доказали, что генетическую информацию несет не только ДНК бактерий, но и ДНК вирусов.

Позже, в 1956 г. было показано, что у РНК-содержащих вирусов генетическая информация также представлена нуклеиновой кислотой, а не белком. Доказано это было в экспериментах с вирусом табачной мозаики (ВТМ). Разные штаммы этого вируса, отличаются разными особенностями заражения листьев табака, аминокислотным составом вирусного белка и другими свойствами. Частицы вирусов были разделены на белок и на РНК. Если затем смешать раствор РНК и вирусного белка, то частицы вирусов ресинтезируются (восстанавливают свою структуру). Это происходит даже в тех случаях, когда смешивают РНК от одного штамма, а белок – от другого. Эксперименты показали, что во всех таких случаях, ресинтезированные частицы вирусов всегда были генетически идентичны тем штаммам, от которых брались молекулы РНК. Характер белка, формирующего капсид (оболочку) ресинтезированных частиц ВТМ, не влиял на генетические свойства этих вирусов.

Вскоре учёные получили исчерпывающие доказательства, что генетическая информация сосредоточена в молекулах нуклеиновых кислот. Исследования явления трансформации у высших организмов показали, что путем простого введения молекул ДНК в клетки можно передавать гены от одной генетической формы к другой у тутового шелкопряда, дрозофилы, бабочки мучнистой огневки, нейроспоры, петунии, перца и мыши.

Эти и другие факты окончательно доказали, что молекулы ДНК используются вирусами, бактериями, растениями, животными и человеком в качестве материальной основы наследственности. Лишь у немногих вирусов генетическая информация записана в РНК.

2.1.2. Количество ДНК в геномах разных организмов

Генόм – это вся совокупность наследственного материала, заключённого в гаплоидном наборе хромосом данного вида организмов. Геном видоспецифичен, т.е. у каждого вида организмов он индивидуален, т.к. представляет собой набор генов, который обеспечивает формирование видовых признаков и свойств организмов в процессе их онтогенеза. Вполне очевидно, что более высокоорганизованные организмы должны иметь больший по величине и сложности наследственный аппарат. Действительно, содержание ДНК в клетке, как правило, увеличивается с возрастанием сложности организма и, следовательно, с возрастанием количества генетической информации.

Самые маленькие геномы имеют некоторые РНК-содержащие вирусы. Их геном представлен только 3 генами или последовательностям из нескольких тысяч нуклеотидов. Самые мелкие ДНК-содержащие вирусы имеют 9 генов и содержат около 5400 пар нуклеотидов (фаг φХ174). Более крупные вирусы, например, Т2 имеют около 150 генов.

Таблица 2.1. Содержание ДНК в некоторых клетках и вирусах

Таблица 1

Бактерии содержат около 0,01∙10–6 мкг ДНК на клетку (приблизительно 1% сырого веса). ДНК E. coli состоит из 3,8∙106 нуклеотидных пар. Такое количество нуклеотидов позволяет закодировать около 4000 различных белков. Так как некоторые гены выполняют функции, не связанные с биосинтезом белка, то реальное число генов, кодирующих белки, несколько меньше. Поскольку расстояние между нуклеотидными парами равно 0,34 нм, то полная длина молекулы ДНК в хромосоме E. coli равна 1,3 мм, что в 600 раз превышает длину клетки, в которой она находится.В клетках высших организмов количество ДНК в 100-1000 раз больше, чем в клетках бактерий. В среднем оно составляет приблизительно 6∙10–6 мкг на клетку (табл. 2.1). Длина всей ДНК диплоидной клетки человека достигает почти 2 м [Бреннан Р, 1997, с. 237]. Общее количество генов в геноме человека, по последним данным, достигает 32 тысяч. Однако общее количество ДНК в клетке разных видов организмов не следует рассматривать как простой показатель функциональной и структурной сложности организма. Например, в клетках дрозофилы и человека содержится соответственно в 18 и 1000 раз больше ДНК, чем в клетках кишечной палочки E. coli. В то же время в клетках двоякодышащей рыбы ДНК в 12 раз больше, чем в клетках человека.


Таблица 02

Содержание ДНК в диплоидных клетках организма данного вида в большинстве случаев не зависит от типа клетки и ткани, которую она составляет. Половые клетки эукариот содержат точно половину того количества ДНК, которое обнаруживается в диплоидных клетках (табл. 2.2).

Таким образом, в целом, чем сложнее эволюционная организация организмов, тем большее количество ДНК содержится в клеточных ядрах этих существ. Некоторые исключения из этого общего правила существуют и являются предметом пристального изучения молекулярных биологов. Соматические клетки организма одного вида содержат почти одинаковое количество ДНК, а в его гаплоидных клетках количество ДНК вдвое меньше, чем в соматических.

 

2.1.3. Состав и химическое строение нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты являются материалом, играющим главную роль в хранении и передаче наследственной информации. Структура нуклеиновых кислот сложна, но знать их химическое строение необходимо для понимания многих молекулярно-генетических процессов.

 

2.1.3.1. Химический состав нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты – это биологические высокомолекулярные полимерные соединения, мономерами которых являются нуклеотиды. Нуклеотиды – это сложные органические соединения, в состав которых входят молекулы азотистого основания, пентозного сахара и фосфорной кислоты.

Рис. 2.7. Схема строения рибонуклеотида.

Каждый нуклеотид состоят из трех химически разных частей: 1) остатка сахара пентозы; 2) азотистого основания (в виде производного пиримидина или пурина; 3) остатка фосфорной кислоты (рис. 2.7). В зависимости от особенностей химического строения нуклеиновые кислоты разделяют на две группы – дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК).

В нуклеиновых кислотах сахар представлен пентозой. В РНК пентоза является рибозой, а в ДНК – дезоксирибозой. Они состоят из пяти атомов углерода и определённого числа атомов Н и О. Четыре атома углерода и один атом кислорода образуют пятичленное кольцо, а пятый атом углерода включен в группу НО–СН2. Чтобы избежать путаницы в нумерации атомов азотистых оснований и сахаров, положения атомов углерода в молекуле пентозы нумеруют от 1 до 5 со штрихом – 1C′, 2C′, 3C′, 4C′ и 5C′ [Льюин Б., 1987, с. 25]. Нумерацию этих атомов и их расположение в кольце относительно 1) азотистого основания, 2) ОН-группы и 3) остатка фосфорной кислоты, связанных ковалентной связью, соответственно, с 1C′-м, 3C′-м 5C′-м атомами углерода, необходимо запомнить. Это связано с тем, что важные процессы копирования и считывания генетической информации с молекул нуклеиновых кислот происходят в строго определённых направлениях, а атомы углерода в пентозе служат своеобразными указателями направления этих процессов.

Рис. 2.8. Сахара, входящие в состав молекул РНК и ДНК.

Рибоза отличается от дезоксирибозы тем, что в рибозе С-2′-атом имеет ОН-группу, а в дезоксирибозе она заменена на атом водорода (рис. 2.8). К первому атому углерода (С-1′) в молекуле пентозы присоединятся одно из азотистых оснований. Они представлены четырьмя типами: двумя пуринами – аденином (А) и гуанином (Г) и двумя пиримидинами – цитозином (Ц) и тимином (Т). В молекулах РНК встречаются нуклеотиды, содержащие ещё одно пиримидиновое основание – урацил (У).

В учебной и научной литературе часто встречаются обозначения нуклеотидов символами латинского алфавита. В этом случае аденин, тимин, цитозин, гуанин и урацил обозначают буквами A, T, C, G и U, соответственно.

Рис. 2.9. Пуриновые и пиримидиновые основания, входящие в молекул нуклеиновых кислот

Пиримидины (цитозин, тимин и урацил) содержат шестичленные кольца из двух атомов азота и четырех атомов углерода (рис. 2.9). Все эти атомы имеют свои номера – от 1 до 6. Цитозин отличается от тимина группами, присоединенным к углеродам в положениях 2 и 6

Пурины (аденин и гуанин) – это сложные гетероциклические соединения, состоящие из двух конденсированных гетероциклов: пиримидина и имидазола. В целом пурины содержат четыре атома азота и пять атомов углерода. Атомы в этой молекуле нумеруют от 1 до 9. Аденин отличается от гуанина по группам в положениях 2 и 6.

Соединение одного из пуринов (А или Г) или пиримидинов (Ц или Т) с остатком сахара образует нуклеозид. После присоединения к нуклеозиду фосфатной группы возникает нуклеотид, содержащий основание, сахар и фосфатную группу. Фосфатная группа присоединяется к нуклеозиду, заменяя в дезоксирибозе группу ОН в положении 5′ (рис. 2.10).

Рис. 2.10. Образование дезоксирибонуклеотида путём соединения фосфата, дезоксирибозы и азотистого основания.

Соединение нуклеотидов в макромолекулу нуклеиновой кислоты происходит путем взаимодействия фосфата одного нуклеотида с гидроксилом пентозы другого нуклеотида. В результате взаимодействия между двумя нуклеотидами возникает фосфодиэфирная связь (рис. 2.11). Эти фосфодиэфирные связи между сахаром и фосфатом определяют «скелет» молекулы ДНК. В результате образуется полинуклеотидная цепь.

Сборка полинуклеотидной цепи осуществляется при участии фермента ДНК-полимеразы. Полимераза обеспечивает присоединение фосфатной группы следующего нуклеотида к гидроксильной группе, стоящей в положении 3' предыдущего нуклеотида (рис. 2.11). Благодаря этой особенности полимеразы, наращивание полинуклеотидной цепи происходит только на одном конце – там, где находится свободный гидроксил в положении 3'. Начало цепи всегда несет фосфатную группу в положении 5'. Эта особенность строения полинуклеотидной цепи позволяет выделить в ней 5'- и 3'-концы.

Таблица 2.3. Различия в химсоставе РНК и ДНК

Молекулы РНК и ДНК различаются по химическому составу. Эти отличия состоят в указанных выше различиях между сахарами (рибозой и дезоксирибозой). Кроме того в РНК среди оснований нет тимина, он заменен на урацил (У), в котором в положении 5 вместо группы СН3 (свойственной тимину) находится атом Н (рис. 2.9, табл. 2.3).

Рис. 2.11. Первичная структура ДНК. Схема соединения нуклеотидов в полинуклеотидную цепь.

Нуклеотиды – это мономеры, из которых строится полинуклеотидная цепь. Соединение друг с другом двух нуклеотидов дает динуклеотиды, трех – тринуклеотиды, затем – тетрануклеотиды, и так вплоть до цепи из сотен тысяч нуклеотидов в виде длинных линейных, неразветвленных полинуклеотидов. Полинуклеотидные молекулы РНК имеют молекулярную массу 1,5-2,0 млн. и состоят из 4-6 тыс. нуклеотидов. Полинуклеотиды ДНК – это обычно гигантские, органические молекулы, имеющие тысячи, миллионы и даже миллиарды нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов в цепи молекулы является первичной структурой молекулы ДНК (рис. 2.11, 2.13). Длина молекулы ДНК у фага φХ174 составляет 1,8 мкм, из митохондрий мыши – 5 мкм, у дрозофилы – 1,1∙107 мкм. Максимальная длина ДНК в клетке свойственна человеку – 150 см (3,5∙109 нуклеотидов) [Дубинин Н.П., 1986, Горбунова В.Н., Баранов В.С., 1997].

В начале века исследователи полагали, что ДНК имеет периодическое строение, т.е. в ней расположены одни и те же, периодически повторяющиеся группы нуклеотидов. Таково было содержание теории П. Левина о тетрануклеотидном строении нуклеиновых кислот. По этой теории в основе строения ДНК лежал тетрануклеотид в составе А, Г, Т и Ц. ДНК любой молекулярной массы представлялась как тетрануклеотид, повторенный n раз. Однако специальными исследованиями было установлено, что ДНК разных организмов различается по количественному соотношению пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти данные показали несостоятельность тетрануклеотидной теории.

Рис. 2.12. Некоторые минорные (модифицированные) азотистые основания, обнаруженные в нуклеиновых кислотах. Модификации обведены рамками.

Позже было показано, что молекулы ДНК имеют апериодическое строение. Нуклеотиды четырёх типов (А, Т, Г, Ц) следуют один за другим в линейной молекуле без каких-либо законов, заложенных в химии этой молекулы. Вместе с тем для каждого конкретного вида организмов данная апериодичность нуклеотидов строго постоянна. Как будет показано далее, именно этот порядок нуклеотидов и обусловливает обширную и сложную генетическую информацию, свойственную каждому виду организмов.В составе некоторых нуклеиновых кислот помимо азотистых оснований А, Т, Г и Ц в небольших количествах были обнаружены другие нуклеотиды, получившие название минорных (рис. 2.12). Оказалось, что минорные основания – это необычные, главным образом метилированные формы обыкновенных оснований (аденина, тимина, гуанина, цитозина и урацила). Так в ДНК животных и высших растений некоторая часть цитозинов заменена 5-метилцитозином. В ДНК ряда фагов вместо цитозина имеется 5-оксиметилцитозин. Содержание минорных оснований наиболее высоко в транспортных РНК (до 10% от общего содержания нуклеотидов). Позже учёные выяснили, и мы это покажем в дальнейших разделах, что минорные основания играют важную роль в регуляции генетической активности.

Рис. 2.13. Первичная структура ДНК. Вертикальной стрелкой обозначено направление роста цепи.

Молекулы ДНК в большинстве случаев являются линейными, а также могут быть замкнуты в кольцо. Кольцевые молекулы свойственны хромосомам и плазмидам бактерий, ДНК вирусов, а также ДНК митохондрий и пластид в клетках эукариот.

В 1950 г. американский биохимик Эрвин Чаргафф (рис. ) установил важнейшую закономерность химического строения ДНК, согласно которой сумма пуриновых оснований равна сумме пиримидиновых оснований. Причем количество аденина равно количеству тимина: А=Т или А/Т=1; количество цитозина равно количеству гуанина: Г=Ц или Г/Ц =1. Эти количественные соотношения азотистых оснований в ДНК стали называть правилом Чаргаффа. Установленная закономерность свидетельствовала о том, что в молекулах ДНК определенный пурин и определенный пиримидин связаны в пары (пары оснований). Подробнее...

Рис. Эрвин Чаргафф (1905-2002).

Отношение сумм нуклеотидов ((А+Т):(Г+Ц)) у разных видов различается и варьирует от 0,35 до 2,70. В целом ДНК близких видов имеют очень сходный нуклеотидный состав. В то же время эволюционно отделённые организмы, как правило, по нуклеотидному составу сильно отличаются друг от друга. В этом проявляется определённая видовая специфичность ДНК. Она позволяет использовать нуклеотидный состав ДНК как таксономический признак.

2.1.3.2. Модель строения ДНК

Английский биофизик Морис Уилкинс (род. 1916, лауреат Нобелевской премии 1962 г.) выполнил рентгеноструктурный анализ молекул ДНК и установил двунитевое строение этих молекул. Данные по химии ДНК и ее рентгенограмма были использованы для создания модели строения молекулы ДНК и объяснения её роли как носителя генетической информации.

В 1953 г. американский молекулярный биолог Джеймс Уотсон и английский физик и генетик Френсис Крик (рис. 1.22 и 1.23), основываясь на данных Э. Чаргаффа и М. Уилкинса, а также Розалинды Франклин построили модель пространственной структуры молекулы ДНК.

Рис. Розалинда Франклин (1920-1958) - английский биофизик и учёный-рентгенограф, занималась изучением структуры ДНК.

В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф. Крика молекула ДНК состоит из двух длинных комплементарных полинуклеотидных цепей, закрученных в правильную двойную спираль.

Скелетная основа полинуклеотидных цепей содержит правильно чередующиеся сахара и фосфаты, связанные ковалентными связями. Две углеводно-фосфатные цепи расположены на внешней стороне молекулы ДНК, в то время как азотистые основания находятся внутри ее, перпендикулярно оси спирали. Эти цепи соединяются друг с другом водородными связями между их азотистыми основаниями, формируя вторичную структуру ДНК. Аденин одной цепи соединяется двумя водородными связями с тимином другой цепи. Между гуанином и цитозином образуются три водородные связи (рис. 2.14). Такое соединение азотистых оснований обеспечивает прочную связь двух цепей и сохранение равного расстояния между ними на всем протяжении и называется комплементарностью. Комплементарность – это пространственная взаимодополняемость молекул или их частей, приводящая к образованию водородных связей. Комплементарность каждой отдельной пары оснований создаёт комплементарность двух полинуклеотидных цепей в целом. Например, если в одной цепи имеется порядок нуклеотидов
....– Т – Ц – Г– Г – Т – Ц – Ц – ....
то в другой этот порядок будет иметь следующий вид:
....– А – Г– Ц – Ц – А – Г – Г – ....

Причиной спаривания именно пуринов с пиримидинами является то, что пара из двух пуринов была бы слишком велика, а пара из двух пиримидинов – слишком мала для укладки в правильную спираль молекулы ДНК. Водородные связи, возникающие между пуринами и пиримидинами, удерживают комплементарные полинуклеотидные цепи в системе единой молекулы. Поскольку каждый остаток фосфорной кислоты удерживается фосфодиэфирными связями с 5'-углеродом одного остатка сахара и 3'-углеродом другого остатка сахара, молекулы нуклеиновой кислоты обладают полярностью, которая условно обозначается как направление 5' → 3'. В молекулах ДНК две полинуклеотидные цепи имеют противоположное направление в отношении связей 5'–3' и 3'–5', т.е. они антипараллельны (рис. 2.14).

Рис. 2.14. Вторичная структура ДНК. Стрелками обозначена антипараллельность цепей.

Ковалентные связи между атомами в углеводно-фосфатной цепи полинуклеотида имеют определённую пространственную ориентацию, обусловленную так называемыми торсионными углами вращения химических связей. В результате этой пространственной ориентации ковалентных связей в обоих углеводно-фосфатных антипараллельных цепях полинукеоидов, вся молекула ДНК закручивается в правозавитковую спираль. Эта двойная полинуклеотидная спираль является третичной структурой молекулы ДНК (рис. 2.15).

Рис. 2.15. Третичная структура ДНК.

Диаметр двойной правозакрученной спирали ДНК составляет около 2 нм, один поворот спирали (шаг) – 3,4 нм. В каждом витке (шаге) спирали находится 10 пар нуклеотидов, расстояние между нуклеотидами равно 0,34 нм.

Таким образом, в структурной организации молекулы ДНК выделяют три уровня:
первичную структуру – последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи (рис. 2.13);
вторичную структуру – две комплементарные друг другу и антипараллельные полинуклеотидные цепи, соединенные водородными связями (рис. 2.14);
третичную структуру – трехмерную спираль с определёнными пространственными характеристиками (рис. 2.15, 2.16).

Чаще всего двойные спирали являются правозакрученными – при движении вверх вдоль оси спирали цепи поворачиваются вправо. Большинство молекул ДНК в растворе находится в правозакрученной В-форме (В-ДНК, А-ДНК и др.). Однако встречаются также левозакрученные формы (Z-ДНК). Какое количество этой ДНК присутствует в клетках и каково ее биологическое значение, пока не установлено (рис 19). Кроме указанных форм ДНК молекулярные биологи обнаружили и другие варианты третичной структуры (А, С, D, E; подробнее см.: [Льюин Б., 1987 с. 29-32].

Рис. 2.16. Левозакрученная Z-форма и две правозакрученные формы (В и А) ДНК. [Льюин Б., 1987; Сингер М., Берг П., 1998].

Как правило, в хромосомах и в цитоплазматических органеллах ДНК имеет двунитевую структуру. Лишь у некоторых вирусов молекулы ДНК представлены одной полинуклеотидной цепью. Примерами таких вирусов могут быть фаги φХ174 и S13. Существование организмов лишь с одной цепочкой ДНК свидетельствует о том, что для синтеза белков в клетке достаточно функционирования одной полинуклеотидной нити. Однако двунитевое состояние молекул ДНК обеспечивает им большую химическую устойчивость при метаболических процессах в клетке. Это имеет огромное биологическое значение для сохранения той генетической информации, которую несёт в себе ДНК.


 

2.2. Репликация ДНК

Одним из основных свойств ДНК является её способность к репликации. Репликация – это процесс самовоспроизведения макромолекул нуклеиновых кислот, обеспечивающий точное копирование генетической информации и передачу её от поколения поколению. В основе механизма репликации лежит ферментативный синтез одной цепи ДНК на другой цепи-матрице ДНК. (Примечание: в литературе возможно встретить синонимичные названия этого процесса – авторепродукция, редупликация, ауторепликация.) Свойство репликации обусловлено оригинальной химической структурой ДНК, состоящей из двух комплементарных цепей. В процессе репликации на каждой из двух полинуклеотидных цепях материнской молекулы ДНК синтезируются комплементарные им цепи. В итоге из одной двойной спирали ДНК образуются две идентичные двойные спирали. Такой способ удвоения молекул, при котором каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную цепь, назван полуконсервативным.

2.2.1. Молекулярный механизм репликации ДНК

Наблюдения с помощью электронного микроскопа показали, что репликация начинается не с конца линейной молекулы. Например, у фага Т7, имеющего линейную молекулу ДНК, репликация начинается на внутреннем участке на 17% длины всей молекулы, от левого конца.

Репликация как у про-, так и у эукариот начинается с образования особой структуры – репликативного глаза (син.: репликационного глаза), где две цепи родительской ДНК отделяются друг от друга, и в местах расхождения полинуклеотидных цепочек начинается синтез дочерних цепей. Это приводит к появлению в молекуле ДНК петли в виде участка, расплетенного на две отдельные нити (рис. 2.17). Участок нуклеиновой кислоты, с которого начинается репликация называется точкой инициации репликации или ориджином (локус ori, от англ.: origin) [подробнее см.: Жимулёв И.Ф., 2002, с.112-117]. Этот участок содержит последовательность, состоящую из 300 нуклеотидов. Именно эта последовательность узнается специальными белками, необходимыми для начала репликации. Область расхождения двойной спирали ДНК на одинарные полинуклеотидные цепочки в зонах репликации называют репликативной вилкой (репликационной вилкой). Постепенное разъединение цепей молекулы ДНК происходит при разрыве водородных связей между пуринами и пиримидинами.

Репликация может происходить либо в одном, либо в дух направлениях. При однонаправленной репликации (рис. 2.17, Б) вдоль ДНК движется одна репликационная вилка. При двунаправленной репликации (рис. 2.17, В) от точки начала в противоположных направлениях расходятся две репликативные вилки.

Рис. 2.17. Однонаправленная и двунаправленная репликация ДНК [Льюин Б., 1987].

На определённом расстоянии от точки инициации молекула ДНК содержит участок, в котором репликация останавливается. Этот участок ДНК носит название точки терминации (син.: точки окончания) репликации.

Участок ДНК от точки инициации репликации до точки ее окончания образует единицу репликации – репликон. Начавшись в точке инициации, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован. Кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток имеют один локус ori и представляют собой целиком отдельные репликоны. Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов. Поэтому удвоение молекулы ДНК, начинается в нескольких точках. Это ускоряет процесс репликации больших молекул ДНК эукариот. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.

Первоначально механизм репликации ДНК был изучен у прокариотических организмов. Было установлено, что самокопирование ДНК осуществляется при посредстве комплекса специальных ферментов. Функции основных ферментов этого комплекса рассмотрены ниже.

Рис. 2.18. Область репликационной вилки в молекуле ДНК. Объяснения см. в тексте.

Для осуществления репликации цепи материнской ДНК должны быть отделены друг от друга, чтобы стать матрицами, на которых будут синтезироваться комплементарные цепи дочерних молекул (рис. 2.18). Такое разделение комплементарных полинуклеотидных цепочек происходит с помощью фермента геликазы. Двойная спираль ДНК в определённой зоне (локус ori) расплетается. К образующимся при этом одноцепочечным участкам прикрепляются специальные белки. Их называют дестабилизирующими белками (от англ.: helix-destabilizing proteins) или SSB-белками (от англ.: single-strand DNA-binding proteins). Молекулы этих белков выстраиваются вдоль полинуклеотидных цепей, растягивают их остов. В результате азотистые основания разъединённых цепей становятся доступными для связывания с комплементарными нуклеотидами, поступающими из нуклеоплазмы. В каждой репликативной вилке при участии фермента ДНК-полимеразы синтезируется ДНК двух новых дочерних молекул (рис. 2.20, 2.35). Процесс этот достаточно сложен и будет рассмотрен ниже. В процессе синтеза ДНК репликационная вилка движется вдоль материнской спирали, захватывая все новые зоны.

ДНК-полимераза E. coli состоит из одной полипептидной цепи, содержащей около 1000 аминокислотных остатков. В одной бактериальной клетке содержится около 300 молекул этого фермента [Стент Г., Кэлиндар Р., 1981].

Рис. 2.19. Разрыв одной из цепей ДНК с помощью фермента ДНК-топоизомеразы:

Геликаза, разделяя спирально закрученные цепи материнской ДНК, вызывает появление супервитков (т.е. сильную спирализацию молекулы ДНК) перед репликационной вилкой. Супервитки ДНК возникают потому, что при расхождении каждых 10 пар нуклеотидов, образующих один виток спирали, материнская ДНК должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для продвижения репликационной вилки верёд вся молекула ДНК перед ней должна была бы быстро вращаться. Такое вращение потребовало бы большой затраты энергии. В действительности же вращения не происходит благодаря действию особого фермента – ДНК-топоизомеразы. Топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК и совершает оборот вокруг второй (целой) цепи как вокруг оси вращения (рис. 2.19). Это устраняет супервитки и ослабляет накопившееся напряжение в двойной спирали ДНК. После снятия избыточного напряжения фермент восстанавливает разорванную цепь.

В настоящее время известно, что суперспирализацию снимает несколько топоизомераз. Описанные выше действия (разрез одной цепочки ДНК и оборот вокруг второй, целой цепи) совершает топоизомераза I. Другой фермент – топоизомераза II создаёт временный двухцепочечный разрыв и, удерживая вместе оторванные друг от друга концы цепей, манипулирует ими. Действия этого фермента позволяют распутывать сложные петли и узлы [Жимулёв И.Ф., 2002, с.113].

А–ДНК-топоизомераэа образует ковалентную связь с одной из фосфатных групп ДНК (верхняя цепь); Б– в результате разрыва фосфодиэфирной связи в одной полинуклеотидной цепи вокруг соответствующей ей связи другой цепи осуществляется вращение, которое снимает напряжение, вызванное расхождением двух цепей ДНК в области репликационной вилки; В– после снятия напряжения в спирали ДНК происходит спонтанное отделение ДНК-топоизомеразы и восстановление фосфодиэфирной связи в цепи ДНК.

Освобождающиеся водородные связи нуклеотидов двух разъединённых родительских цепей служат своеобразными магнитами, притягивающими из нуклеоплазмы свободные нуклеотиды, которые находятся в нуклеоплазме в виде дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Комплементарный нуклеозидтрифосфат образует водородные связи с комплементарным основанием материнской цепи ДНК. Затем при участии фермента ДНК-полимеразы он связывается фосфодиэфирной связью с предшествующим нуклеотидом вновь синтезируемой цепи, отдавая при этом неорганический пирофосфат (рис. 2.20).

Рис. 2.20 . Присоединение очередного нуклеотида к дочерней цепи ДНК, синтезируемой при участии ДНК-полимеразы: Ф-Ф – пирофосфат.

ДНК-полимераза присоединяет очередной нуклеотид к ОН-группе только в 3'-положении предшествующего нуклеотида. Поэтому цепь постепенно удлиняется на ее 3'-конце.

Особенностью ДНК-полимеразы является ее неспособность начать синтез новой полинуклеотидной цепи путем простого связывания двух нуклеозидтрифосфатов. Ей необходим 3'-ОН-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, спаренной с матричной цепью ДНК, к которой ДНК-полимераза может лишь добавлять новые нуклеотиды. Такую полинуклеотидную цепь называют праймером или затравкой. Праймером для начала синтеза цепи ДНК является короткая последовательность РНК, образуемая на ДНК при участии фермента РНК-праймазы (рис. 2.21). Длина праймеров варьирует от 10 до 100 нуклеотидов [Дубинин Н.П.; 1986; Ярыгин В.Н. и др., 1997 ].

Рис. 2.21. Схема реакции синтеза короткой РНК-затравки, катализируемой РНК-праймазой.

Так как ДНК-полимераза способна осуществлять сборку полинуклеотида только в одном направлении – от 5'- к 3'-концу, то процесс репликации протекает на антипараллельных цепях-матрицах ДНК по-разному (см. рис. 2.23). На одной из матриц (3'→5') сборка новой цепи происходит непрерывно от 5'- к 3'-концу и она постепенно удлиняется на 3'-конце. Другая цепь, синтезируемая на матрице (5'→3'), должна расти от 3' к 5'-концу, но это противоречит направлению действия фермента ДНК-полимеразы. В настоящее время установлено, что синтез второй цепи ДНК осуществляется также в направлении от 5'- к 3'-концу, но не непрерывно, а многочисленными короткими фрагментами, получившими название фрагментов Оказаки. Так они названы в честь открывшего этот процесс молекулярного генетика Рейджи Оказаки (рис. 2.22).

Рис. 2.22. Рейджи Оказаки.


Суть репликации второй цепи ДНК фрагментами Оказаки состоит в следующем. Синтез каждого нового фрагмента Оказаки начинается с образования РНК-затравки. После того, как образуется новый фрагмент ДНК, он должен быть соединён с ранее синтезированной дочерней цепью полинуклеотидов. Но перед этим у самого последнего из синтезированных фрагментов должна быть удалена затравка. Удаляет эту затравку и присоединяет новый фрагмент к ранее синтезированной цепи фермент ДНК-лигаза (рис. 2.23).

Рис. 2.23 . Два последовательных этапа синтеза дочерних цепей ДНК на разных цепях-матрицах материнской молекулы. Мультипликацию этого процесса вы можете посмотреть здесь.

Из-за различий в механизмах синтеза копий на двух разных цепях материнской ДНК репликативная вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей одна строится непрерывно. Поэтому её синтез идет быстрее. Поэтому эту цепь называют лидирующей. Синтез другой цепи идет медленнее, потому что она собирается из отдельных фрагментов, требующих многократного формирования, а затем удаления РНК-затравки. Поэтому эту цепь называют запаздывающей (отстающей). Хотя на ней отдельные фрагменты образуются в направлении 5'→3', в целом эта цепь растет в направлении 3'→5'.

Процесс репликации завершается образованием двух дочерних молекул ДНК. Их нуклеотидные последовательности идентичны нуклеотидным последовательностям материнской двойной спирали ДНК. Завершение репликации происходит в специальных участках ДНК. У E. coli они называются ter-сайтами и содержат короткую последовательность (около 23 пар) нуклеотидов.

Рис. 2.24. Две группы терминации репликации у E. coli [Жимулёв И.Ф., 2002].

У E. coli обнаружены две группы ter-сайтов (рис. 2.24). В первой группе ter-сайтов останавливается движение первой репликационной вилки, во второй группе ter-сайтов – движение второй. Они располагаются примерно в 100 тпн от той точки, в которой встречаются вилки репликации.

Для окончания репликации ДНК необходим специальный белок. У бактерии E. coli он кодируется геном tus. Этот белок распознаёт терминаторную последовательность, связывается с ней и останавливает дальнейшее продвижение вилки репликации.

Таким образом, репликация ДНК является сложным процессом, в котором участвует большое количество ферментов (рис. 2.25). ДНК-геликаза расплетает двойную спираль, разделяя её полинуклеотидные цепи. Дестабилизирующие белки выпрямляют участок цепи ДНК и предотвращают восстановление двойной спирали. ДНК-топоизомераза разрывает фосфодиэфирную связь в одной из полинуклеотидных цепей ДНК, снимая напряжение, вызываемое расплетением спирали и расхождением цепей в репликационной вилке.


Рис. 2.25. Белки, участвующие в процессе репликации ДНК.

РНК-праймаза синтезирует РНК-затравки для дочерней лидирующей цепи и для каждого фрагмента Оказаки дочерней отстающей цепи. ДНК-лигаза сшивает фрагменты Оказаки после удаления РНК затравки. Активность этих ферментов зависит от многих факторов. Это позволяет клетке при необходимости регулировать скорость репликации ДНК.

У бактерий молекула ДНК замкнута в кольцо. Репликация таких, замкнутых в кольцо, молекул имеет ряд характерных особенностей и может происходить двумя путями.

При репликации первым путём синтез дочерних цепей происходит при сохранении кольцевой структуры молекулы ДНК (рис. 2.26).

Рис. 2.26. Упрощённая схема двунаправленной репликации кольцевых молекул ДНК. Видеофильм (англ. яз).

На электронномикроскопических фотографиях реплицирующаяся молекула напоминает своей формой греческую букву Ө (тета). После того как молекула ДНК будет реплицирована полностью, обе кольцевые копии оказываются «продеты» одна в другую, как два кольца цепи. Они должны быть разъединены. Этот процесс осуществляет топоизомераза II. Фермент разрезает одну из кольцевых молекул, сквозь разрыв выводит петлю неразорванной молекулы, а затем воссоединяет концы разрезанной молекулы, вновь превращая её в кольцо [Сингер М., Берг П., 1998, т.1. с. 82-86].

Второй путь, по которому может осуществляться репликация кольцевых молекул ДНК, получил название «катящегося кольца» («rolling circle»). Так образуется много новых молекул вирусных ДНК, половой процесс у бактерий и амплификация генов. В этом случае репликация начинается со специфического разрыва одной материнской цепи двойной спирали ДНК (рис. 2.27). Это приводит к появлению однонитевых 5'- и 3'-концов. Конец 5' вытесняется из двойной спирали и с ним связывается фермент ини. По мере раскручивания молекулы величина освобожденной одноцепочечной матрицы от конца 5' увеличивается. На ней происходит синтез комплементарной дочерней нити ДНК. В результате образуется постепенно увеличивающийся свободный «хвост».

img27

Рис. 2.27. Удвоение кольцевой молекулы ДНК по механизму «катящегося кольца».

Одновременно с освобождением с конца 5' одноцепочечной матрицы освобождается однонитевая матрица на кольцевой одинарной нити ДНК. Синтез на кольцевой нити может идти на протяжении нескольких оборотов молекулы. В результате длина образованной линейной молекулы может превышать длину одного генома. Многократно повторенный синтез копии цепи на кольцевой нити ДНК приводит к появлению линейная нить, содержащей несколько повторов одного и того же генома. Такую нить называют конкатемером. Она разрезается специальными ферментами (рестриктазами) на куски, каждый из которых равен длине хромосомы (генома). После появления таких кусков они замыкаются в кольцевые хромосомы (рис. 2.27).

У вирусов, имеющих одноцепочечную ДНК, механизм её репликации тот же, что и у двуцепочечных молекул, однако генетическую значимость в этом случае имеет только одна нить. Эту нить обозначают знаком +. Когда (+)-нить поступает в клетку она достаивает комплементарную нить, образуя двуцепочечную молекулу ДНК, содержащую (+)-нить и (–)-нить. После размножения вирусов в образующуюся частицу фага включается только (+)-нить ДНК.

Рис. 2.28. Схема репликации ДНК в соответствии с «моделью тромбона» [Жимулёв И.Ф., 2002].

К настоящему времени установлено, что процессы, идущие в репликативной вилке, ещё более сложны (рис. 2.28). ДНК-геликаза, две ДНК-полимеразы на обоих дочерних цепях и праймаза на отстающей цепи образуют единый полиферментный комплекс – реплисому. Отстающая цепь изгибается таким образом, что её ДНК полимераза комплексирует с ДНК-полимеразой лидирующей цепи. Этот изгиб подводит 3′-конец каждого уже синтезированного фрагмента Оказаки к тому участку, где начинается синтез нового фрагмента Оказаки. Комплекс геликаза-праймаза-полимераза движется вместе с вилкой репликации и синтезирует новые РНК-праймеры. ДНК полимераза на отстающей цепи продвигается вперёд вместе с репликационной вилкой и многократно используется для синтеза фрагментов Оказаки. Таким образом, ДНК синтезируется одинаково эффективно на обеих материнских цепях ДНК (матрицах). Эта схема репликации ДНК получила название «модели тромбона».

2.2.2. Различие репликации у прокариот и эукариот

В общих чертах механизм и последовательность процессов репликации у прокариот и эукариот сходны. Однако есть и некоторые различия. Пять основных различий перечислены ниже

1) Продолжительность клеточного цикла у эукариот варьирует от 10 мин до 200 часов. Поэтому и продолжительность репликации у эукариот больше, чем у прокариот.

2) Роль точек инициации репликации прокариот (ориджинов) у эукариот выполняют автономно реплицирующиеся последовательности (ARS) открытые в 1980 году у дрожжей, а затем обнаруженные у многих высших организмов. С этими автономно реплицирующимися последовательностями связываются специальные белки, инициирующие процесс репликации (подробнее см.: [Жимулёв И.Ф., 2002, с.121]).

3) Размеры репликонов у эукариот значительно меньше, чем у прокариот, хотя в пределах генома одного вида они могут варьировать десятикратно (табл. 2.4 ).

Таблица 2.4. Параметры репликации ДНК в геномах эукариот и прокариот

Организмы Число
репликонов
Средняя длина
репликонов (тпн)
Скорость движения
вилки репликации (тпн/мин)
Бактерии 1 4200 50,0
Дрожжи 500 40 3,6
Дрозофила 3500 40 2,6
Лягушка 15000 200 0,5
Мышь 25000 150 2,2
Растения 35000 300 нет данных

4) В клетках прокариот фрагменты Оказаки синтезируются длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. У эукариот они значительно короче – от 100 до 200 нуклеотидов.

5) Скорость синтеза ДНК у прокариот в области репликационной вилки (1000 нуклеотидов/с) на порядок выше, чем у эукариот (около 100 нуклеотидов/с). Высокую скорость репликации обеспечивает указанные выше ферменты – геликаза, топоизомераза, дестабилизирующие белки, ДНК-полимераза, РНК-праймаза, ДНК-лигаза и др., совместно действующие в области репликативной вилки (рис. 2.25). Вместе с тем, меньшая скорость репликативного синтеза у эукариот объясняется большей степенью конденсации (упаковки) ДНК в хромосомах, а также более сложной и тщательной «проверкой» правильности синтезируемой дочерней цепи специальными репарирующими системами.

2.3. Репарация ДНК

Организмы и их клетки на протяжении всей своей жизни, а также в ряду поколений должны сохранять свои основные свойства и признаки. Поэтому при делении клеток репликация наследственного материала должна происходить очень точно. Кроме того, наследственный материал должен быть очень устойчивым к внешним воздействиям, способным нарушать структуру ДНК. Но, поскольку случайные нарушения структуры ДНК в процессе репликации и функционирования всё-таки возможны, то должны существовать механизмы, исправляющие эти нарушения.

В настоящее время известно, что шибки, при которых вместо комплементарного основания в данной паре включается некомплементарное, обнаруживают с частотой, равной 10–9-10–10 [Дубинин Н.П., 1986]. Вместе с тем, расчёты, учитывающие физико-химические свойства ДНК, показывают, что ошибочные включения в цепь некомплементарных нуклеотидов, должны происходить с частотой 10–5, т.е. на 4-5 порядков выше той частоты, которая наблюдается в живой клетке. Столь значительное снижение частоты ошибок обеспечивают специальные механизмы, получившие название репарационных механизмов или просто – репарации. В зависимости от периода клеточного цикла, в течение которого происходит репарация повреждений ДНК, её подразделяют на пострепликативную и дорепликативную. Пострепликативная репарация – это ферментативный процесс исправление ошибок в ДНК, идущий сразу после её синтеза.

Нарушения структуры молекулы ДНК могут возникать не только в процессе репликации, но и на стадии нереплицирующейся двуспиральной молекулы ДНК. Чтобы сохранять структуру ДНК нормальной, и не позволять повреждениям ДНК реализоваться в виде мутаций, клетка должна исправлять повреждения до того, как ДНК начнёт реплицироваться. Устранение повреждений в двунитевой ДНК с помощью специальных ферментов до начала нового цикла репликации называется дорепликативной репарацией.


img29

Рис. 2.29. Типы репарационных механизмов.

В учебных изданиях прежних лет излагаются различные классификации типов репарации. Здесь изложен современный вариант классификации [Жимулёв И.Ф., 2002], в основу которой положены особенности биохимических механизмов репарации. Репарацию подразделяют на 4 типа (рис. 2.29): прямую, эксцизионную, рекомбинационную и SOS-репарацию. Каждая из них реализуется с помощью определенного набора ферментов.

Одни репарационные системы непосредственно корректируют повреждения, в то время как другие репарационные системы вначале вырезают повреждения, образуя одноцепочечные бреши, и затем синтезируют новую цепь ДНК, застраивая брешь. Повреждения, не исправленные репарационными системами, реализуются как мутации. Если мутаций возникнет слишком много, клетка погибнет.

2.3.1. Прямая коррекция мутационных повреждений

Прямая репарация – это наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (обычно – в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина. Подробнее...

2.3.1.1.Самокоррекция ДНК-полимеразой

Самокоррекция – это отщепление ДНК-полимеразой ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей (рис. 2.30) и присоединение комплементарного нуклеотида. Высокую точность репликации осуществляет фермент ДНК-полимераза, синтезирующий дочернюю цепь. Этот фермент отбирает нужные нуклеотиды из имеющихся в нуклеоплазме нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), присоединяет их к матричной цепи ДНК и химически связывает в растущую дочернюю цепь. Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1∙10–5 пар оснований. Это происходит из-за возникновения химически измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Примером может служить измененная форма цитозина, которая вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате этого в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную форму нарушает его связывание с матрицей. В результате появляется неспаренный 3'-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции, осуществляемый ДНК-полимеразой. Было установлено, что большинство бактериальных полимераз кроме полимеризующей активности в направлении 5'→3' имеет ещё и экзонуклеазную активность в направлении 3'→5'. Если встраивается «неправильный» нуклеотид, ошибка чаще всего (хотя и не всегда) распознается полимеразой, вероятно, из-за того, что в этом месте в двойной спирали образуется пузырь или впячивание. «Неправильный» нуклеотид не может сформировать водородную связь с комплементарным основанием. Поэтому полимераза не может добавить новый нуклеотид к растущему 3'-ОН-концу. Процесс репликации останавливается до тех пор, пока «неправильный» нуклеотид не будет удален полимеразой, и на его место ею не будет поставлен нужный. В результате самокоррекции частота ошибок снижается в 10 раз (с 10–5 до 10–6).

img30

Рис. 2.30. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК.
А – включение в цепь ДНК нукеотида с изменённой (таутомерной) формой цитозина, который «незаконно» спаривается с аденином;
Б – быстрый переход цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3′-ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему её удлинению под действием ДНК-полимеразы;
В – ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3′-ОН-конец;
Г – ДНК -полимераза продолжает наращивание цепи на 3′-ОН-конце.

У эукариотических ДНК-полимераз 3'→5'-экзонуклеазной активности не обнаружено.

Несмотря на эффективность самокоррекции, после удвоения ДНК в ней всё равно обнаруживаются ошибки. Причины их возникновения могут быть различными:
1) Одной из причин является нарушение в нуклеоплазме нормальных концентраций четырех нуклеозидтрифосфатов.
2) Значительная часть изменений возникает в молекулах ДНК в результате спонтанной апуринизации (т.е. потери пуриновых оснований – аденина и гуанина) или из-за дезаминирования цитозина, который превращается в урацил.
3) Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием ультрафиолета и реакционноспособных соединений; в результате этих изменений нормальное спаривание нуклеотидов нарушается.

Перечисленные выше нарушения в ДНК должны привести в очередном цикле репликации либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. И эти события действительно происходят в каждом цикле репликации ДНК. Однако их частота значительно меньше теоретически ожидаемой.

2.3.1.2. Фотореактивация

Если микроорганизмы облучить ультрафиолетовым (УФ) светом в очень большой дозе – они погибнут. Происходит это из-за того, что в результате УФ-облучения в ДНК происходят химические изменения тиминов, расположенных рядом. Они образуют друг с другом 4 ковалентные связи, формируя димеры (рис. 2.31). В результате этого нарушается считывание информации с ДНК и её репликация.

img31

Рис. 2.31. Образование димеров тимина при УФ облучении (2800 Å) и разрезание димера при активации фотореактивирующего фермента видимым светом (2400 Å) [Дубинин Н.П., 1986].

В 1949 г. было обнаружено, что освещение актиномицетов, бактериофага и парамеций видимым светом восстанавливает их жизнеспособность после УФ-облучения в летальных дозах. Это явление было названо фотореактивацией. Тиминовые димеры, возникшие в результате УФ-облучения, под действием видимого света разрушаются, и тимины возвращаются к своей исходной форме (рис. 2.32).

Фотореактивацию катализирует фермент фотолиаза, кодируемый геном phr. Этот фермент активируется фотоном света и расщепляет димер на исходные составляющие. Однако не все тиминовые димеры могут быть фотореактивированы; их исправляют другие репарационные механизмы Фотолиаза обнаружена у прокариот и у низших эукариот. У человека фотолиаза не найдена.

img32

Рис. 2.32. Репарация тиминового димера фотореактивацией.

2.3.1.3. Репарация алкилирующих повреждений

Присоединение к нуклеотидам алкильных или метильных групп приводит к химическим изменениям нуклеотидов и, следовательно, генетическим повреждениям ДНК. Такие повреждения репарируются путём удаления этих групп специфическими ферментами. Следует заметить, что в этой репарирующей системе модифицированное основание не удаляется из ДНК. В подобных случаях фермент распознает метилированное азтистое основание в ДНК и удаляет метильную группу, превращая основание в исходную форму.

2.3.1.4. Репарация полинуклеотидлигазой

Многие факторы, например, ионизирующее излучение, могут вызывать однонитевые разрывы ДНК. Эти разрывы устраняются прямой репарацией другого типа – с помощью фермента ДНК-полинуклеотидлигазы. Этот фермент осуществляет прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК.

2.3.2. Механизмы репарации, связанные с эксцизией пар оснований

В тех случаях, когда исправление самого нуклеотида невозможно, клетка исправляет ошибку другим, уже кардинальным путём – она старается вырезать либо единичный неверный нуклеотид, либо некоторую последовательность нуклеотидов.

 

2.3.2.1. Эксцизия единичных нуклеотидов

Единичные измененные азотистые основания репарируются путём их вырезания. Клетки содержат фермент гликозилазу, которая обнаруживает ненормальное основание и катализирует его отделение от дезоксирибозы. Происходит это путем разрушения гликозидной связи между основанием и сахаром (рис. 2.33, А). В результате в том месте, где удалено основание ДНК возникает брешь. Эта брешь называется АП-сайтом (апуриновым, если нет А или Г, или апиримидиновым, если отсутствуют Ц или Т). Фермент АП-эндонуклеаза опознает наличие бреши и разрезает нить ДНК с 5'-конца от поврежденного основания (рис. 2.33, Б). Затем удаляется фосфат на 5'-конце надрезанной нити (рис. 2.33, В) с помощью фосфодиэстеразной активности ДНК-полимеразы β. Образовавшаяся брешь из одного нуклеотида заполняется ДНК-полимеразой β (рис. 2.33, Г) и запечатывается ДНК-лигазой (рис. 2.33, Д).

img33

Рис. 2.33. Вырезание единичного нуклеотида гликозилазой.

К настоящему времени описано много типов гликозилаз, каждый из которых узнает разнообразные поврежденные основания, такие как метилированные, окисленные, восстановленные, дезаминированные, а также основания, связанные с формамидными группировками.

Активность ДНК-полимеразы I в этой системе репарации, когда фермент создает новую цепь ДНК и удаляет нуклеотиды впереди растущей цепи ДНК, называется ник-трансляцией (рис. 2.34) [Жимулёв И.Ф., 2002].

2.3.2.2. Эксцизия нуклеотидных последовательностей

img34

Рис. 2.34. Ник-трансляция в ходе репарации гликозилазами [Жимулёв И.Ф., 2002, с. 220].

Существуют ещё более сложные процессы восстановления правильной структуры ДНК, когда достаточно протяжённые поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК, а затем образовавшиеся бреши заполняются неповрежденным материалом (рис. 2.35). Эти процессы были открыты в 1964 г. У чувствительных к УФ-свету мутантов E. coli после облучения ультрафиолетом обнаруживали более высокий, чем в норме, уровень мутаций, индуцируемых в темноте. Эти мутации были названы uvrA (UV-repair – репарация УФ). Мутанты uvrA могут репарировать димеры только с потреблением света, т. е. они имеют нормальную систему фотореактивации. Поэтому предположили, что должна быть другая система репарации, которая не требует света. Эта система была названа темновой или эксцизионной репарацией. Так как клетки дикого типа могут репарировать димеры в темноте, аллель дикого типа называют uvrА+.

Эксцизионная система репарации у E. coli корректирует не только пиримидиновые димеры, но и другие серьезные нарушения ДНК. Нарушение опознается эндонуклеазой, мультисубъединичным ферментом, кодируемым тремя генами – uvrA, uvrB и uvrC. Этот фермент делает надрез в поврежденной цепи через 8 нуклеотидов в 5'-сторону от димера и второй надрез – через 4 нуклеотида с 3'-стороны. Затем 12-нуклеотидная цепь, содержащая повреждение, удаляется, брешь заполняется с помощью 5'-3'-полимеризующей активности ДНК-полимеразы I и запечатывается ДНК-лигазой. Аналогичный, но ещё более сложный механизм репарации существует у эукариот (см.: [Жимулёв И.Ф., 2002], с. 219). Эксцизионная репарирующая система найдена у большинства изученных организмов.

img35

Рис. 2.35. Последовательные этапы репарации одноцепочечной молекулы ДНК после образования димера тимина. Под действием эндонуклеазы и ДНК-полимеразы I   димер тимина вырезается, образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой III комплементарными нуклеотидами и сформировавшийся участок сшивается лигазой.

Модель репарации эксцизией нуклеотидов у эукариот (рис. 2.36): Вначале повреждения ДНК опознаются ХРА-белком (xeroderma pigmento-sum-A) в ассоциации с RPA (рис. 36, А), затем привлекается фактор транскрипции TFIIH, показанный на этом рисунке состоящим из 6 субъединиц, включая ХРВ и XPD, чья геликазная активность «открывает» структуру ДНК (рис. 36, Б). Это позволяет специфическим нуклеазам ERCC1-XPF и XPG надрезать ДНК по обе стороны от повреждения (В). Точная функция ХРС-белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК, до конца не ясна, но известно, что он требуется до надрезания ДНК нуклеазами. ДНК-полимераза ε (эпсилон) и вспомогательные белки RFC и PCNA застраивают образовавшуюся брешь (Г). Фрагмент новой цепи соединяется со старой цепью ДНК-лигазой (Д).Репарация неспаренных оснований. Довольно часто (у E. coli с частотой 1∙10–5, а у эукариот – ещё чаще) во время репликации ДНК происходят ошибки спаривания. В результате этого вместо комплементарной пары нуклеотидов А-Т или G-C в дочернюю цепь ДНК оказываются включенными нуклеотиды, не комплементарные нуклеотидам в материнской нити.

img36

Рис. 2.36. Репарация эксцизией нуклеотидов у эукариот [Жимулёв И.Ф., 2002].

Их называют мисмэтчами – (от англ.: mismatch – несоответствие; ошибочный выбор). Такие ошибки корректируются с помощью мисмэтч-системы репарации. У Е.соli в процесс репарации по этой схеме вовлечены продукты четырех генов: mutS, mutL, mutH и mutU (см.: [Жимулёв И.Ф., 2002], с. 221). Неправильное спаривание (ошибка репликации) может затронуть только дочернюю нить ДНК, т.к. матричная нить в процессе репликации остается неизменной. Следовательно, система репарации мисмэтчей должна действовать на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Как клетка распознаёт материнскую цепь (матрицу) и как отличает от неё дочернюю цепь? В 70-х гг. прошлого столетия было установлено, что клетки используют важное различие в структуре матричной и дочерней нитей. Оказалось, что вскоре после окончания репликации специальные ферменты – метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательностях GATC. Поэтому во время следующего раунда репликации нити ДНК оказываются различимыми: материнская нить несет метилированные аденины, а в дочерней их модификация начнется только по окончании репликации. Пока они остаются неметилированными, клетки должны успеть выполнить репарацию мисмэтчей.

Процесс начинается с того, что к некомплементарной паре мисмэтча присоединяется белок MutS. С ним тут же связываются белок MutL и две молекулы белка MutH. Белок MutH способен распознать участок GATC и обладает эндонуклеазной активностью. Благодаря этим свойствам белок MutH разрезает нить ДНК вблизи аденина в неметилированной (т.е. дочерней) нити. Надрезы могут быть внесены как в 5'-, так и в 3'-положение относительно аденина. Мультимолекулярный комплекс, составленный из этих белков, массивен и связывает длинный фрагмент ДНК. Этот фрагмент ДНК протягивается через комплекс до тех пор, пока два участка GATC, расположенные по обе стороны от мисмэтча, удерживаемого белком MutS, не окажутся захваченными молекулами белка MutH. Иногда расстояние между участками GATC может превышать несколько тысяч нуклеотидов. Благодаря своей эндонуклеазной активности MutH разрезает дочернюю нить. Если такой надрез сделан с 5'-стороны от аденина, к нему присоединится еще один белок – экзонуклеаза, которая расщепит нити ДНК в направлении 5'→3'. Этот белок разрушит всю дочернюю нить до места неправильного спаривания и даже пройдет несколько дальше. Первичный надрез может быть сделан и с 3'-стороны мисмэтча. В этом случае потребуется другая экзонуклеаза, двигающаяся по ДНК в направлении 3'→5'. Ее работа будет продолжаться до тех пор, пока не будет устранен участок мисмэтча. Затем в обоих случаях, как с 5'-3'-, так и с 3'-5'-экзонуклеазой, бреши застраиваются ДНК-полимеразой, а концы воссоединены с помощью лигаз. Разумеется, для высвобождения концов нитей после внесения первичных разрезов молекула ДНК должна быть расплетена (требуется белок геликаза), нужны также источники энергии в виде АТР, а для застройки брешей – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Такой процесс репарации обнаружен в клетках человека, дрожжей и некоторых других организмов.

Объектом узнавания ферментами репарации могут служить и разрывы в цепи ДНК. Так как у высших организмов синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, то вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание.

2.3.3. Пострепликативная, или рекомбинационная, репарация.

Этот способ восстановления целостности ДНК заключается в репарации пробелов, образующихся в дочерних цепях напротив не удаленных в ходе репликации димеров пиримидинов. Основная часть таких пробелов репарируется путем рекомбинационных обменов между двумя сестринскими молекулами ДНК.

В клетках процесс пострепликативной репарации контролируется по крайней мере 17 генами. Процесс происходит следующим образом (рис. 2.37).
1. Из комплементарной нити матричной ДНК (она была свободна от дефектов), на которой репликация уже завершена, с помощью белка RecA вырезается участок ДНК, равный по длине участку бреши, и встраивается в эту брешь.
2. Затем лигазы соединяют концы вставленного фрагмента с концами нормально синтезированного участка дочерней нити. После этого другие ферменты репарации устраняют дефект в исходно повреждённой нити, и ДНК восстанавливает правильную последовательность нуклеотидов.
3. Одновременно брешь, оставшаяся после вырезания участка из материнской нити застраивается ДНК полимеразой I и концы соединяются лигазой.

img37

Рис. 2.37. Пострепликативная репарация ДНК.
1 – молекулы белка RecA (изображены чёрными овалами) присоединяются к зоне бреши,
2 – под контролем белков RecA происходит рекомбинация – участок комплементарной цепи сестринской нити (серая) переносится в район бреши,
3 – брешь в сестринской ДНК застраивается в ходе репликативного синтеза (застроенный участок показан тёмно-серым цветом), концы новой и старой нитей соединяются лигазой [Жимулёв И.Ф., 2002, с. 222].

2.3.4. SOS-репарация

Что случится, если клетка подошла к моменту, когда нужно реплицировать ДНК, но в ней остались повреждения, которые ни одна из описанных выше систем репарации так не смогла устранить? Репликация застопорится на первом же не устранённом повреждении. Если таких не устранённых повреждений в ДНК много, клетка должна погибнуть. В подобных условиях в клетке активируется еще один, крайне рискованный, механизм репарации, обнаруженный впервые в 1974 г. и названный SOS-репарацией. Было установлено, что при SOS-репарации индуцируется синтез специальных белков. Они присоединяются к ДНК-полимеразному комплексу и делают возможным построить дочернюю ДНК напротив дефектных звеньев матричной цепи. В результате SOS-репарации клетка спасается на этом этапе: ее ДНК оказывается удвоенной, хотя и с ошибкой, и теперь может произойти клеточное деление. Но если её жизненно важные функции все-таки безнадежно испорчены, такая клетка позже все равно погибнет.

Данные о распространенности различных репарирующих систем в живом мире представлены в табл. 2.5.

Таблица 2.5. Распространение систем репарации среди разных типов организмов [Жимулёв И.Ф., 2002]

Примечание. Не найдено ферментов репарации в митохондриях эукариот

С дефектами систем репарации связаны некоторые наследственные болезни человека. Так, в 1968 г. Дж. Кливер нашел, что причиной неизлечимой болезни – пигментной ксеродермии являются дефекты разных репарирующих систем. У носителей болезни под действием обычного солнечного света, в котором всегда присутствуют УФ-лучи, на коже возникают красные пятна, которые постепенно переходят в незарастающую коросту, чаще всего трансформирующуюся в раковые опухоли.

В настоящее время известно, что многие другие наследственные болезни человека обязаны своим возникновением повреждениям отдельных этапов различных процессов репарации.

2.4. Генетический код. Способ записи генетической информации в ДНК

Проблема взаимоотношения белков и нуклеиновых кислот в клетке – центральный вопрос всего учения о наследственности. Специфическая связь изменений в гене с модификацией первичной структуры белка впервые была установлена при анализе мутации, изменившей у человека структуру переносящего кислород белка – гемоглобина.

Молекула белка гемоглобина состоит из четырех цепей: две α-цепи содержат по 141 аминокислоте и две β-цепи – по 146 аминокислот. В молекуле гемоглобина число разных аминокислот равно 19, общее число аминокислот – 574.

В 1949 г. Дж. Нил установил, что тяжелая форма злокачественной анемии у человека наследуется как рецессивная мутация. Эритроциты больных людей имели форму серпа, что послужило основанием для названия болезни – серповидноклеточная анемия. В том же году П. Полинг с сотрудниками показали, что здоровые люди отличаются от больных электрофоретической подвижностью гемоглобина.

В 1956 г. В. Ингрем обнаружил химические различия между белками нормального гемоглобина и гемоглобина эритроцитов больных людей. После гидролиза молекул белков трипсином при использовании электрофореза и бумажной хроматографии, белки двух гемоглобинов были им разделены на 30 малых пептидов. Сравнивая хроматограммы обоих гемоглобинов, он обнаружил, что их различия касаются небольшой части одной из полипептидных цепей. Во фрагменте молекулы гемоглобина из эритроцитов больных людей (HbS) аминокислота глутамин, свойственная гемоглобину из эритроцитов нормальных людей (НbА), была заменена на аминокислоту валин:

НbА: Вал—Гис—Лей—Тре—Про—Глу—Глу—Лиз

HbS: Вал—Гис—Лей—Тре—Про—Вал—Глу—Лиз

Сравнение показало, что мутация в гене (т.е. изменение в первичной структуре ДНК), обусловливает изменение в первичной структуре белка, который синтезируется под контролем данного гена. В молекуле белка произошли минимальные изменения в виде замены всего одной аминокислоты из 292, которые входят в состав двух β-полипептидных цепей. Последствия от такой, казалось бы, малой замены оказались пагубными для организма человека. Молекула гемоглобина потеряла способность к транспорту кислорода, а это приводит к смерти новорожденного. Этот анализ связи мутаций ДНК с модификацией синтеза белков послужил началом нового учения о молекулярных болезнях человека.

Таким образом, отдельные гены детерминируют синтез специфических белков. Более того, доказано, что внутригенная молекулярная структура ДНК соответствует структуре кодируемых геном молекул белков. Это явление получило название колинеарности ДНК гена и кодируемого им белка. В следующих разделах этой главы будет раскрыт механизм этого явления.

В 1954 г. американский физик-теоретик Г.А. Гамов предположил, что кодирование информации в молекулах ДНК должно осуществляться сочетаниями нескольких нуклеотидов. В самых разнообразных белках, существующих в природе, было обнаружено всего около 20 различных аминокислот. Для шифровки такого количества аминокислот четырьмя различными нуклеотидами достаточен триплетный код. В таком коде каждая аминокислота шифруется тремя стоящими рядом нуклеотидами. В этом случае из четырех нуклеотидов образуется 43 = 64 триплета. Код, состоящий из двух нуклеотидов, дал бы возможность зашифровать только 42 = 16 различных аминокислот. Тетраплетный код (т.е. из четырёх нуклеотидов) был бы чрезмерно избыточным. Итак, генетический код триплетен.

Полная расшифровка генетического кода проведена в 60-х гг. ХХ столетия (табл. 2.6). Из 64 возможных триплетов ДНК 61 кодирует различные аминокислоты, оставшиеся 3 получили название бессмысленных, или «нонсенс-триплетов» Они не шифруют аминокислот и выполняют функцию знаков препинания (стоп-кодонов) при считывании наследственной информации. К стоп-кодонам относят триплеты АТТ, АТЦ, АЦТ в молекуле ДНК и комплементарные им мРНК-триплеты УАА, УАГ, УГА.

В таблице 2.6 показано, что каждой аминокислоте соответствует от одного (метионин, триптофан) до шести (лейцин, аргинин, серин) кодонов. Таким образом, многие аминокислоты шифруются несколькими триплетами. Это свойство триплетного кода, названное вырожденностью или избыточностью, имеет важное биологическое значение. Вырожденность генетического кода позволяет при мутационной замене в триплете третьего нуклеотида сохранять смысл закодированной информации. Возникшее таким образом новое сочетание из трех нуклеотидов будет кодировать ту же самую аминокислоту. Вместе с тем, различные кодоны, кодирующие одну и ту же аминокислоту (например, лейцин или аланин у дрозофилы), с неодинаковой частотой используются в геномах (см. табл. 2.7).

Таблица 2.6. Генетический код мРНК (подчеркнуты кодоны-терминаторы)

ПОДПИСЬ К ТАБЛИЦЕ 2.6 (РИСУНКОМ) ПОТЕРЯНА?


img38

 

 

Таблица 2.7. Частота использования разных кодонов, кодирующих лейцин и аланин, у дрозофилы [Ashburner, 1989, по: 6, с.125].


Аминокислота Кодон Число случаев
Лейцин CUU
CUC
CUA
CUG
610
1096
538
3425
Аланин GCC
GCA
GCU
GCG
3534
926
1397
1159

Рис. 2.38. Круговое представление генетического кода.

Генетический код может быть представлен в круговой форме (рис. 2.38) [Инге-Вечтомов С.Г., 1983]. Буквы в центре круга – первые буквы кодонов, вокруг расположены буквы, соответствующие второму положению в кодоне, и, наконец, третий круг – третье положение в кодоне. Четвертое кольцо образуют аминокислотные остатки, представленные в виде трехбуквенных сокращений. Во внешнем круге отмечены физико-химические свойства аминокислот, а именно являются ли они полярными (п) или неполярными (нп).

В процессе изучения свойств генетического кода была обнаружена его специфичность. Каждый триплет способен кодировать только одну определенную аминокислоту. Следует подчеркнуть, что в любом данном участке ДНК только одна из двух нитей ДНК кодирует аминокислоты. Поэтому генетический код – это последовательность нуклеотидов, а не пар нуклеотидов.

Генетический код характеризуется однонаправленностью считывания (5′→3′), т.е. считывание информации с мРНК при синтезе белка происходит с её 5′-конца в направлении 3′-конца). Этот механизм считывания подробно будет рассмотрен ниже, при анализе механизма синтеза белка.

Генетический код у различных видов живых организмов совершенно одинаков. Такая универсальность генетического кода свидетельствует о единстве происхождения всех живых форм на Земле.

Незначительные отличия генетического кода обнаружены в ДНК митохондрий некоторых видов (табл. 2..8). Это не противоречит в целом положению об универсальности кода. Вместе с тем, эти различия свидетельствуют о существовании различных путей эволюции разных организмов на ранних этапах существования жизни. Генетический код митохондриальной ДНК был расшифрован. Во всех случаях в митохондриальных ДНК установлена общая особенность: триплет АЦТ читается как АЦЦ, и поэтому из нонсенс-триплета он превращается в шифр аминокислоты триптофана. Другие особенности митохондриальной ДНК являются специфичными для различных видов организмов. У дрожжей триплет ГАТ кодирует вместо аминокислоты лейцина треонин. У млекопитающих триплет ТАГ аналогичен триплету ТАЦ и кодирует аминокислоту метионин вместо изолейцина. Триплеты ТЦГ и ТЦЦ в ДНК митохондрий некоторых видов не кодируют аминокислот, являясь нонсенс-триплетами.

Другими важнейшими характеристиками генетического кода являются его непрерывность и неперекрываемость. Это означает, что последовательность нуклеотидов считывает триплет за триплетом без пропусков. При этом соседние триплеты не перекрывают друг друга, т.е. каждый отдельный нуклеотид входит в состав только одного триплета при заданной рамке считывания. Однако, наряду с тем, что многие свойства генетического кода, в том числе и неперекрываемость, характерны для большинства живых организмов, современные исследования показали существование некоторых исключений из правил. Некоторые из них описаны ниже.

Таблица 2.8. Отклонения от универсального генетического кода

Геном Организмы Кодоны Универсальное значение Необычное значение
Митохондрии

Позвоночные, дрозофила, дрожжи, плесени, трипаносомы UGA Stop Trp
Сахаромицеты CUU
CUC
CUA
CUG
Leu Thr
CGG Arg Trp
Позвоночные, дрозофила, сахаромицеты AUA Ile Met
Морская звезда ААА Lys Asn
Позвоночные AGA
AGG
Arg Stop
Морская звезда, дрозофила AGA
AGA*
Arg Ser
Аскарида, нематода UUG Leu Start
AUU Ile Start
Нематода AUA Ile Start
Млекопитающие AUU
AUC
AUA
Ile Start
Ядро Микоплазма UGA Stop Trp
Цилиаты UAA
UAG
Stop Gln
Гриб кандида цилиндрика CUG Leu Se

A* – модифицированный аденин

Генетический материал мелкого бактериофага φХ174 представлен одноцепочечной ДНК и состоит всего из 9 генов, продукты которых хорошо изучены. Необходимая для кодирования этих продуктов ДНК должна содержать минимум 6078 нуклеотидов. На самом же деле в хромосоме фага φХ174 находится всего 5374 нуклеотида. Это несоответствие удалось объяснить после того, как в 1978 г. группой Ф. Сэнгера было проведено полное секвенирование ДНК этого фага. Оказалось, что кодирующие последовательности двух генов (В и Е) локализованы внутри кодирующих последовательностей двух других генов (А и D). При этом рамка считывания (т.е. триплет, прочитываемый при трансляции) в каждом случае оказывалась сдвинутой на одну пару нуклеотидов. Например, в определенном участке внутри гена D находится последовательность

img39

которая в полипептиде D кодирует последовательность валин-тирозин-глицин-треонин. Рамка считывания гена Е смещена вправо на один нуклеотид от рамки считывания гена D. Поэтому триплет ATG распознается как стартовый, и в полипептиде Е появляется формил-метионин, за которым последует валин, кодируемый триплетом GTA, и т. д.

Сходным образом кодирующая последовательность гена В оказывается внутри кодирующей последовательности гена А. В результате сдвига рамки считывания кодируемые перекрывающимися генами полипептиды полностью отличаются друг от друга по последовательностям аминокислот.

Подобная ситуация «ген внутри гена» известна и в ряде других случаев. Частично перекрывающиеся кодирующие последовательности обнаружены в ДНК вируса млекопитающих SV40. У РНК-содержащего фага MS2 один из генов перекрывает два других и, следовательно, не перекрывается лишь один из фаговых генов:

img40

При анализе одного из мобильных генетических элементов у бактерий – элемента IS5 был обнаружен еще более яркий пример сверхкомпактной организации генетической информации. В этом случае одна из цепей молекулы ДНК содержит два перекрывающихся гена, а комплементарный им участок второй цепи образует третий ген. Следовательно, в этом случае обе цепи значимы и несут информацию, соответствующую трем генам:

img41

По результатам выполнения проекта «Геном Е. coli» обнаружено, что у 405 пар смежных генов вообще нет межгенных интервалов: знак начала трансляции одного гена частично перекрывается с конечным знаком другого, например:


img42

Таким образом, основными свойствами генетического кода являются:
– триплетность;
– вырожденность (избыточность);
– специфичность;
– универсальность;
– непрерывность;
– неперекрываемость;
– однонаправленность (5′→3′) считывания.

2.5. Транскрипция

Транскрипция – это процесс синтеза матричной (информационной) РНК на матрице ДНК.

Наследственная информация, записанная с помощью генетического кода, хранится в молекулах ДНК. При репликации ДНК наследственная информация дублируется. Благодаря дублированию каждая вновь образовавшаяся клетка получает все генетические «инструкции» для нормального развития и функционирования. Вместе с тем непосредственного участия в жизнеобеспечении клеток ДНК не принимает. Посредниками, передающими наследственную информацию от ДНК к структурным белкам, являются рибонуклеиновые кислоты (РНК).

В отличие от молекул ДНК, рибонуклеиновые кислоты состоят из одинарной полинуклеотидной цепи, которая содержит четыре разновидности нуклеотидов, содержащих сахар рибозу, фосфат и одно из четырех азотистых оснований – аденин, гуанин, урацил или цитозин. РНК синтезируется на молекулах ДНК с соблюдением принципа комплементарности и антипараллельности. В РНК аденину ДНК комплементарен урацил. Процесс синтеза молекулы РНК на ДНК-матрице называют транскрипциией

2.5.1. РНК-полимераза

img43

Рис. 2.39. Пространственная модель комплекса РНК-полимеразы E. coli с фрагментом ДНК. Цифрами обозначены местоположения нуклеотидных звеньев цепи ДНК (отсчёт выполняется от точки инициации транскрипции) [Овчинников Ю.А., 1987, с. 122].

Транскрипция происходит при участии фермента РНК-полимеразы. Установлено, что у E. coli молекула ДНК-зависимой РНК-полимеразы состоит из 5 субъединиц (2 идентичные α-субъединицы, β-, β′-, δ-субъединицы, рис. 2.39) [Овчинников Ю.А., 1987, с. 122]. Обратите внимание на тот факт, что РНК-полимераза, образуя комплекс с ДНК, закрывает собой несколько десятков нуклеотидов. Этот факт очень важен для дальнейшего понимания процессов регуляции работы генов.

Все РНК, действующие в клетке, разделяют на три основных типа: матричные (мРНК), транспортные (тРНК), и рибосомные (рРНК).

2.5.2. Матричная РНК

Синтез мРНК начинается с обнаружения РНК-полимеразой особого участка в молекуле ДНК, который указывает место начала транскрипции – промотора (рис. 2.40, А).

img44

Рис 2.40. Роль РНК-полимеразы в транскрипции [Албертс Б. и др., 1986].
А – обнаружение промоторной области в молекуле ДНК и раскручивание спирали ДНК;
Б – инициация синтеза цепи РНК путем связывания двух первых рибонуклеозидтрифосфатов;
В – наращивание цепи РНК в направлении 5'→3' путем присоединения рибонуклеозидтрифосфатов;
Г – высвобождение 5'-конца синтезируемой РНК и восстановление двойной спирали ДНК;
Д – окончание синтеза РНК в области терминатора, отделение полимеразы от завершенной цепи РНК.

РНК-полимераза присоединяется к промотору. Затем она раскручивает прилежащий к промотору участок спирали ДНК (длиной приблизительно в один виток спирали ДНК). Полинуклеотидные цепи ДНК в этом месте расходятся. На одной из них фермент осуществляет синтез мРНК. Рибонуклеотиды связываются в цепь с соблюдением их комплементарности нуклеотидам ДНК, и антипараллельно по отношению к матричной цепи ДНК. РНК-полимераза способна собирать полинуклеотид лишь от 5'-конца к 3'-концу. Поэтому матрицей для транскрипции может служить только одна из двух цепей ДНК, а именно та, которая обращена к ферменту своим 3'-концом (3'→5'). Эта цепь ДНК называемой кодогенной (рис. 2.40, Б, В).

По мере продвижения РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, пройденные ею одноцепочечные участки ДНК вновь объединяются позади фермента в двойную спираль (рис. 2.40, Г). Продвигаясь вдоль кодогенной цепи ДНК, РНК-полимераза постепенно создаёт точную копию генетической информации в виде мРНК. Происходит это до тех пор, пока РНК-полимераза не встретит на ДНК стоп-сигнал – один из трёх специфических триплетов – АТТ, АТЦ, АЦТ, называемых терминатором транскрипции. Как уже указывалось, в мРНК этим терминаторам транскрипции соответствуют триплеты УАА, УАГ, УГА. Обнаружив стоп-сигнал, РНК-полимераза отделяется от ДНК-матрицы и от вновь синтезированной мРНК (рис.). Участок молекулы ДНК, включающий промотор, транскрибируемую последовательность и терминатор, образует единицу транскрипции – транскриптон.

Синтезированная в ходе транскрипции мРНК содержит точную копию информации, записанной в соответствующем участке ДНК. Тройки рядом расположенных нуклеотидов мРНК, шифрующие аминокислоты, называют кодонами. Последовательность кодонов мРНК шифрует последовательность аминокислот в пептидной цепи. Кодонам мРНК соответствуют определенные аминокислоты (табл., рис.).

2.6. Трансляция

Трансляцией называется синтез полипептидных цепей белков по матрице информационной РНК в соответствии с генетическим кодом. В трансляции участвуют информационные (матричные) РНК, различные транспортные РНК, рибосомы и различные ферменты. Для понимания механизма синтеза белков необходимо знать строение и функции основных участников этого процесса.

2.6.1. Белки

Белки – это высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков аминокислот. Они играют первостепенную роль в жизнедеятельности организмов, выполняя многочисленные функции в их строении, развитии и обмене веществ.

Химическое строение и свойства белков являются предметом биохимии. Мы будем исходить из того, что читатель знает этот вопрос в объёме школьной программы органической химии. Этого вполне достаточно для понимания механизма синтеза белка.

2.6.2. Транспортные РНК

Транспортная РНК. В процессе использования наследственной информации важную роль в клетке выполняют транспортные РНК (тРНК). Основная функция тРНК – доставка необходимых аминокислот к месту сборки пептидных цепей.

Молекулы тРНК представляют собой полинуклеотидные цепи. Молекулы тРНК состоят из 75-95 нуклеотидов. В некоторых участках одноцепочечной молекулы тРНК есть комплементарные участки. В результате их комплементарного соединения молекула тРНК приобретает структуру, напоминающую по форме лист клевера (рис. 2.41).

img45

Рис. 2.41. Строение типичной молекулы тРНК [Албертс Б. и др., 1986].

В молекуле тРНК выделяют четыре главные части, выполняющие различные функции: акцепторную ветвь, антикодоновую ветвь с антикодоновой петлёй, а также две ветви с Т- и D-петлями

Акцепторный стебель образуется двумя комплементарно соединенными концевыми частями тРНК. Он состоит из семи пар оснований. 3'-конец этого стебля несколько длиннее и формирует одноцепочечный участок, который заканчивается последовательностью ЦЦА со свободной ОН-группой. К этому концу присоединяется транспортируемая аминокислота. Остальные три ветви представляют собой комплементарно спаренные последовательности нуклеотидов, которые заканчиваются неспаренными участками, образующими петли. Средняя из этих ветвей называется антикодоновой.

Антикодоновая петля состоит из пяти пар нуклеотидов и содержит в центре своей петли так называемый антикодон. Антикодон – это три нуклеотида, комплементарные тому кодону мРНК, который шифрует аминокислоту, переносимую данной тРНК к месту синтеза пептида.

img46

Рис. 2.42. Третичная структура т-РНК [Овчинников Ю..А., 1987].

Между акцепторной и антикодоновой ветвями располагаются две боковые ветви. В своих петлях они содержат модифицированные основания – дигидроуридин (в D-петле) и триплет с псевдоуридином (в T-петле). Между антикодоновой и Т-ветвями содержится дополнительная небольшая петля, содержащая от 3-5 до 13-21 нуклеотидов, называемая вариабельной петлёй.

В целом различные виды тРНК имеют близкие по строению нуклеотидные последовательности, состоящие обычно из 76 нуклеотидов. Комплементарные участки, поддерживающие структуру тРНК, как правило, консервативны. Изменение количества нуклеотидов в разных тРНК связано главным образом с изменением числа нуклеотидов в вариабельной петле.

Последовательность нуклеотидов в молекуле тРНК является её первичной структурой. В зависимости от неё формируется вторичная структура тРНК, имеющую форму листа клевера. В свою очередь, вторичная структура обусловливает трехмерную третичную структуру. При образовании третичной структуры образуются две перпендикулярно расположенные двойные спирали (рис. 2.42). Одна спираль образована акцепторной и Т-ветвями, другая – антикодоновой и D-ветвями. Стабильность третичной структуры тРНК поддерживают дополнительные водородные связи, возникающие между основаниями полинуклеотидной цепи. Эти основания расположены в разных участках молекулы, но при образовании третичной структуры тРНК, оказываются пространственно сближенными. Различные тРНК имеют сходную третичную структуру, хотя и с некоторыми вариациями.

К концу одной из двойных спиралей тРНК присоединяется транспортируемая аминокислота. На конце другой спирали находится антикодон. Эти участки максимально удаленны друг от друга.

Одной из особенностей тРНК является наличие в ней необычных оснований, возникающих вследствие химической модификации уже после включения нормального основания в полинуклеотидную цепь. Эти измененные основания обусловливают большое структурное многообразие тРНК при общем плане их строения. Наибольший интерес представляют модификации оснований, формирующих антикодон, которые влияют на специфичность его взаимодействия с кодоном. Например, нетипичное основание инозин, иногда стоящий в 1-м положении антикодона тРНК, способен комплементарно соединяться с тремя разными третьими основаниями кодона мРНК – У, Г и А (рис. 2.43). Так как одной из особенностей генетического кода является его вырожденность, многие аминокислоты шифруются несколькими кодонами, которые, как правило, различаются своим третьим основаниями. Благодаря неспецифичности связывания модифицированного основания антикодона одна тРНК может узнавать несколько кодонов-синонимов.

img47

Рис. 2.43. Соединение инозина водородными связями с тремя различными азотистыми основаниями. [Ярыгин В.Н. и др., 1997].

Существуют несколько тРНК, способных соединяться с одним и тем же кодоном. Поэтому в цитоплазме клеток встречается не 61 (по количеству смысловых кодонов), а только около 40 различных молекул тРНК. Но этого количества вполне достаточно, чтобы транспортировать 20 разных аминокислот к месту синтеза белка.

Таким образом, каждая тРНК а) доставляет к месту синтеза пептида строго определенную аминокислоту и б) точно распознаёт порядок её соединения в полипептид благодаря комплементарности её антикодона с кодоном в мРНК.

Безошибочное соединение тРНК со «своей» аминокислотой протекает в два этапа и приводит к образованию соединения, называемого аминоацил-тРНК (рис. 44).

img48

Рис. 2.44. Присоединение аминокислоты к соответствующей тРНК: А – 1-й этап, взаимодействие аминокислоты и АТФ с выделением пирофосфата. Б – 2-й этап, присоединение аденилированной аминокислоты к 3-концу тРНК [Албертс Б. и др., 1986].

На первом этапе аминокислота активируется, взаимодействуя своей карбоксильной группой с АТФ. В результате образуется аденилированная аминокислота.

На втором этапе это соединение взаимодействует с ОН-группой, находящейся на 3′;-конце соответствующей тРНК (рис. 2.44). В итоге этого аминокислота присоединяется к тРНК своей карбоксильной группой, высвобождая при этом АМФ. Таким образом, этот процесс протекает с затратой энергии, получаемой при гидролизе АТФ до АМФ.

Избирательное соединение аминокислоты с соответствующей тРНК обеспечивает фермент аминоацил-тРНК-синтетаза. В цитоплазме клетки находится набор таких синтетаз. Благодаря своей пространственной структуре синтетазы способны одновременно узнавать соответствующие аминокислоту и антикодон в тРНК, соответствующей этой аминокислоте, а затем химически их связывать (рис. 2.45).

img49

Рис. 2.45. Схема трансляции генетического кода:
I – присоединение аминокислоты (триптофана) к соответствующей тРНК с помощью фермента аминоацил-тРНК-синтетазы;
II – присоединение тРНК, несущей свою аминокислоту, к мРНК благодаря связыванию ее антикодона с кодоном мРНК [Албертс Б. и др., 1986].

Таким образом, наследственная информация закодированная в молекулах ДНК вначале переписывается на мРНК, а затем расшифровывается при трансляции. Расшифровка происходит благодаря двум процессам специфического узнавания молекулярных поверхностей. Сначала фермент аминоацил-тРНК-синтетаза обеспечивает соединение тРНК с транспортируемой ею аминокислотой. Затем аминоацил-тРНК комплементарно спаривается с мРНК благодаря взаимодействию антикодона с кодоном. Так с помощью системы тРНК код нуклеотидной цепи мРНК транслируется в язык аминокислотной последовательности пептида (рис. 2.45).

2.6.3. Рибосомы

Взаимодействие мРНК и тРНК, при котором происходит трансляция наследственной информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот, происходит на рибосомах. Рибосома – это сложный мультиферментный комплекс рРНК и разнообразных белков. Рибосомные РНК выполняют в этом комплексе три очень важных функции:

– являются каркасом рибосом (т.е. выполняют функцию структурного компонента);

– обеспечивают связывание рибосомы с определенной нуклеотидной последовательностью мРНК – они определяют начало и рамку считывания кода при образовании пептидной цепи;

– обеспечивают сложное взаимодействие рибосомы и тРНК.

Многочисленные белки, входящие в состав рибосом, выполняют как структурную, так и ферментативную роль.

img50

Рис. 2.46. Форма малой (вверху) и большой (внизу) субъединиц рибосомы [Овчинников Ю.А., 1987].

Рибосомы про- и эукариот очень сходны по структуре и функциям. Они состоят из двух субчастиц: большой и малой (рис. 2.46 и 2.47).

img51

Рис. 2.47. Взаимное расположение большой и малой чубъединиц в рибосоме [Овчинников Ю.А., 1987].

У бактерии E. coli малая субчастица рибосомы состоит из одной молекулы РНК и 21 молекулы рибосомных белков (рис. 2.48). В состав большой субчастицы входят две молекулы РНК и 33 белка. У эукариот малая субчастица образована одной молекулой рРНК и 33 молекулами разных белков.

Большая субчастица объединяет три молекулы рРНК и около 40 белков. Несмотря на существующие различия в структуре, эти рибосомы очень сходны в функциональном отношении.

img52

Рис. 2.48. Сравнение структур прокариотических и эукариотических рибосом [Албертс Б. и др. 1986].

Рибосомы митохондрий и пластид сходны с рибосомами прокариот. При объединении двух субчастиц в рибосомах формируются две бороздки. Одна из них удерживает мРНК, другая – растущую полипептидную цепь. Длина бороздок такова, что в первой из них умещается примерно 35 нуклеотидов мРНК, а во второй – около 30 аминокислот. Кроме того, в рибосомах выделяют два участка, связывающих тРНК– аминоацильный (А-участок) и пептидильный (П-участок) (рис. 2.49, А). Функции этих участков рассматриваются далее.

img53

Рис. 2.49. Схематическое изображение участков связывания мРНК, тРНК и рибосомы [Албертс Б. и др., 1986].

Образование А- и П-участков обеспечивается обеими субчастицами рибосомы. В А-участке размещается аминоацил-тРНК, несущая определенную аминокислоту. В П-участке располагается тРНК, которая нагружена цепочкой аминокислот, соединенных пептидными связями. (рис. 2.49, Б).

2.6.4. Рибосомный цикл синтеза белка

Трансляция генетической информации с «языка» нуклеотидов мРНК на «язык» аминокислот полипептида протекает на рибосомах. Именно рибосомы обеспечивают последовательность расшифровки информации с помощью тРНК. Весь процесс трансляции разделяют на три фазы (стадии): инициацию, элонгацию и терминацию синтеза пептидной цепи. Описанные процессы инициации трансляции катализируются особыми белками – факторами инициации, которые подвижно связаны с малой субчастицей рибосомы. По завершении фазы инициации и образования комплекса (рибосома + мРНК + инициирующая аминоацил-тРНК) эти белки (факторы инициации) отделяются от рибосомы.

Фаза инициации. В молекуле любой мРНК вблизи ее 5'-конца имеется участок, комплементарный определённому участку рРНК малой субчастицы рибосомы. Рядом с ним располагается инициирующий стартовый кодон АУГ, шифрующий аминокислоту метионин. Малая субчастица рибосомы распознаёт комплементарный участок мРНК и соединяется с ним так, чтобы стартовый кодон АУГ расположился в области, соответствующей П-участку. Инициирующая тРНК, несущая метионин, располагается в П-участке малой субчастицы и комплементарно соединяется со стартовым кодоном мРНК. После этого к малой субчастице присоединяется большая субчастица рибосомы, завершая образование пептидильного и аминоацильного участков (рис. 2.50). К концу фазы инициации П-участок занят аминоацил-тРНК, связанной с метионином. В этот момент А-участок рибосомы остаётся свободным и содержит лишь следующий за стартовым кодон мРНК.

img54

Рис. 2.50. Фаза инициации в синтезе белка [Албертс Б. и др., 1986].

Фаза элонгации (фаза удлинения пептида) включает в себя все реакции от момента образования первой пептидной связи до присоединения последней аминокислоты. Она представляет собой циклически повторяющиеся события, при которых происходят следующие процессы (рис. 2.51):

а) специфическое узнавание аминоацил-тРНК очередного кодона, находящегося в А-участке ( начало этапа 1),

б) комплементарное взаимодействие между антикодоном транспортной РНК и кодоном матричной РНК (окончание этапа 1),

в) образование пептидной связи между уже синтезированным фрагментом пептида и аминокислотой, присоединённой к амионоацил-тРНК, поступившей в А-участок (этап 2),

г) отделения аминокислоты от аминоацил-тРНК, находящейся в П-участке (этап 2);

д) удаление тРНК из П-участка (этап 2);

е) сдвиг рибосомы по мРНК на один кодон, в результате чего тРНК, нагруженная пептидной цепочкой, переходит из А-участка в П-участок (этап 3).

Особенность трехмерной структуры тРНК такова, что когда её антикодон связывается с кодоном мРНК, связанная с тРНК аминокислота оказывается в А-участке, рядом с ранее включенной аминокислотой, находящейся в П-участке. Между этими двумя аминокислотами образуется пептидная связь. Образование пептидной связи катализируют специальные белки, входящие в состав рибосомы. В результате связь предыдущей аминокислоты с её тРНК разрушается вся полипептидная цепочка оказывается присоединённой к аминоацил-тРНК, расположенной в А-участке. Оставшаяся в П-участке тРНК (уже без аминокислоты) высвобождается и уходит в цитоплазму.

После освобождения П-участка нагруженная пептидной цепочкой тРНК, перемещается из А-участка в П-участок. Одновременно рибосома продвигается по мРНК на шаг, соответствующий одному кодону. В результате в А-участке оказывается следующий кодон. Здесь его специфически распознает соответствующая аминоацил-тРНК. Она повторит все описанные ранее процессы, в результате которых и её аминокислота будет присоединена к пептидной цепочке. Этот цикл будет повторен столько раз, сколько смысловых кодонов содержится в мРНК.

Фаза терминации. Описанная выше последовательность событий будет повторяться до тех пор, пока в А-участок рибосомы не поступит любой из трёх стоп-кодонов (кодонов-терминаторов) мРНК (УАА, УАГ, УГА) (рис. 2.52).

img55 img56

Рис. 2.51. Фаза элонгации в синтезе белка .

Рис. 2.52. Терминация синтеза пептидной цепи. (Пояснения в тексте).

Для кодона-терминатора не существует транспортной РНК. Вместо неё со стоп-кодоном связывается особый белок – фактор освобождения. При этом к последней аминокислоте в пептидной цепи присоединяется ОН-группа. Вследствие этого синтезированный полипептид отделяется от тРНК, покидает рибосому и поступает в цитоплазму. Рибосома диссоциирует на составляющие её субъединицы и может быть использована для повторного цикла синтеза белка.

Сборка пептидной цепи осуществляется с большой скоростью, зависящей от температуры. У бактерий при 37°С она выражается в добавлении к полипептиду 12-20 аминокислот в 1 с. Таким образом, при оптимальных условиях синтез среднего по размерам белка, состоящего из 400 аминокислот происходит в течение 20 мин [Албертс Б. и др., 1986]. В эукариотических клетках эта скорость ниже и выражается в добавлении двух аминокислот в 1 с.

2.6.5. Особенности транскрипции и трансляции в клетках про- и эукариот

На молекулярном уровне организация материала наследственности в эукариотических и прокариотических клетках принципиально не различается. Генетический материал и в тех и в других клетках представлен ДНК. Общим для них является и принцип записи генетической информации, а также генетический код. Одни и те же аминокислоты шифруются у про- и эукариот одинаковыми кодонами. Принципиально одинаковым образом происходит реализация наследственной информации у про- и эукариот. Сначала эта информация транскрибируется в нуклеотидную последовательность молекулы мРНК. Затем она транслируется в аминокислотную последовательность пептида на рибосомах с участием тРНК. Вместе с тем, у про- и эукариот есть некоторые особенности организации наследственного материала. Эти особенности обусловливают определённые различия в механизмах реализации их генетической информации.

2.6.5.1. Строение и реализация генетического материала у прокариот

Материал наследственности прокариотической клетки содержится, главным образом, в единственной кольцевой молекуле ДНК. Она располагается непосредственно в цитоплазме клетки, где находятся необходимые для экспрессии генов тРНК и ферменты, т.е. наследственный материал и аппарат биосинтеза белка пространственно не разобщены. Поэтому в прокариотической клетке транскрипция и трансляция происходят почти одновременно.

Гены прокариот состоят целиком только из кодирующих нуклеотидных последовательностей. С этих кодирующих последовательностей считывается информация, необходимая для синтеза белков, транспортных РНК и рибосомальных РНК.

2.6.5.1.1. Особенности транскрипции у прокариот

У прокариот синтез РНК всех трех видов (матричных, рибосомальных и транспортных) катализируется одним сложным ферментным комплексом – РНК-полимеразой. Синтез РНК начинается со стартовой точки. Стартовой точкой считают тот нуклеотид ДНК, который первым копируется в РНК-транскрипт. РНК-полимераза находит стартовую точку в молекуле ДНК по специальной нуклеотидной последовательности, которую называют промотором. Промотор может непосредственно примыкать к траскрибируемой последовательности, но очень часто он расположен на определенном расстоянии от стартовой точки транскрипции. Промотор может состоять из нескольких последовательностей нуклеотидов, каждая из которых выполняет свои определённые функции. Мы рассмотрим две такие последовательности – блок Прибнова и область узнавания (рис. 2.53).

У прокариот недалеко от стартовой точки против хода транскрипции располагается последовательность из шести нуклеотидов

–ТАТААТ–,

называемая блоком Прибнова [Льюин Б., 1987].

img57

Рис. 2.53. Точки контакта для РНК-полимеразы (промотор), находящейся в цепи ДНК (изображена верхней цепью) [Льюин Б., 1987, с. 145].

В этой последовательности находятся азотистые основания, соединенные с комплементарными им основаниями другой цепи преимущественно двойными (а не тройными) водородными связями. Это, очевидно, облегчает локальное разделение двойной спирали ДНК в этом участке и образование двух ее одноцепочечных нитей при контакте с РНК-полимеразой. Блок Прибнова – это среднестатистическая последовательность, состоящая из наиболее часто встречаемых оснований. Самыми консервативными из них являются 1, 2 и 6-е основания. Блок Прибнова располагается в положении от (–11) до (–5) или от (–14) до (–8), т. е. за несколько нуклеотидов перед стартовой точкой транскрипции. Обнаружив эту последовательность, РНК-полимераза прочно связывается с ней и начинает синтез РНК.

Столь же важную роль в установлении контакта РНК-полимеразы с молекулой ДНК играет ещё одна нуклеотидная последовательность, называемая областью узнавания – ТТГАЦА–. Центр этой последовательности находится в положении (–35). Расстояние между блоком Прибнова и областью узнавания достаточно постоянно и составляет от 16 до 19 пар нуклеотидов (п. н.).

В некоторых генах обнаружены многокомпонентные промоторы. Так, в отдельных генах вируса герпеса для эффективной инициации транскрипции необходимы три последовательности ДНК, расположенные между (–19) и (–27), между (–47) и (–61), а также между (–80) и (–105) нуклеотидами.

Для инициации транскрипции важно не только сочетание оснований в определенных областях промотора, но и взаимное расположение в молекуле ДНК тех последовательностей нуклеотидов, с которыми связывается ферментный комплекс РНК-полимеразы.

После установления контакта между РНК-полимеразой и промоторным участком начинается синтез молекулы РНК. Первым в состав молекулы РНК чаще всего включается нуклеотид, несущий пуриновое основание (как правило, аденин) и содержащий три 5'-фосфатных остатка. Далее, по мере продвижения РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, происходит постепенное удлинение цепи РНК. Рост цепи РНК продолжается до встречи фермента со специальной областью, сигнализирующей РНК-полимеразе об окончании синтеза. Это область называется терминатором. Терминатор – это участок, где прекращается дальнейший рост цепи РНК и происходит ее освобождение от матрицы ДНК. РНК-полимераза также отделяется от ДНК. После отделения полимеразы ДНК восстанавливает свою двухцепочечную структуру.

В прокариотических клетках терминаторы обязательно содержат палиндромы – двухцепочечные последовательности нуклеотидов ДНК, которые одинаково читаются в обоих направлениях (рис. 2.54).

img58

Рис. 2.54. Палиндромы – области ДНК с двойной симметрией.
А – палиндром, в котором последовательность нуклеотидов одинаково читается в обоих направлениях;
Б – палиндром, в котором инвертированный повтор находится на расстоянии от оси симметрии (это расстояние заштриховано).

Участок мРНК, транскрибированный с такой последовательности, способен образовывать двухцепочечные шпильки за счет комплементарного спаривания нуклеотидов палиндрома (рис. 2.55). Полагают, что шпилька и является сигналом для завершения транскрипции, узнаваемым РНК-полимеразой. Шпильки останавливают полимеразу на терминаторе. Следом за шпилькой в молекулу РНК включается последовательность из урацилов (полиУ). Полагают, что эта последовательность, принимает участие в высвобождении РНК от матрицы ДНК. Предположение основано на том, что полиУ-последовательность РНК характеризуется слабым взаимодействием с полиадениловой (полиА) последовательностью ДНК. Видимо по этой причине участок ДНК, богатый парами АТ, встречается не только в месте инициации транскрипции (блок Прибнова), но и в терминаторной области.

Участок ДНК, на котором синтезируется мРНК, необходимая для синтеза полноценной полипептидной цепи, получил название цистрона. В данном случае понятия «цистрон» и «ген» эквивалентны. Синтезированная на таком участке ДНК матричная РНК, содержащая полную информацию об одной полипептидной молекуле называется моноцистронной. Некоторые бактериальные мРНК являются моноцистронными, но, как будет показано ниже, большая их часть оказывается полицистронными.

Различные бактериальные терминаторы сильно различаются по своей эффективности. РНК-полимераза может «игнорировать» некоторые из терминаторов, и продолжать транскрипцию за их пределами. Такие пропуски терминаторов при транскрибировании бактериальных генов происходят благодаря содействию специальных белков – факторов антитерминации. В результате антитерминации происходит синтез полицистронной мРНК, содержащей информацию, списанную с нескольких последовательно расположенных структурных генов. Большинство прокариотических мРНК является полицистроными.

img59

Рис. 2.55. Образование шпильки участком мРНК при терминации транскрипции у прокариот [Льюин Б., 1987, с. 164]. Пояснения в тексте.

Итак, в состав всех мРНК входят кодирующие участки, которые шифруют последовательность аминокислот в пептиде. Как правило, эти участки начинаются стартовым кодоном АУГ (иногда у бактерий используется кодон ГУГ). На конце кодирующей последовательности располагается терминирующий кодон.

Помимо кодирующих участков в мРНК на обоих концах могут располагаться дополнительные последовательности. На 5'-конце это – лидерный участок, расположенный перед стартовым кодоном. На 3'-конце – трейлер, следующий за кодоном-терминатором. Эти последовательности являются регуляторными и не транслируются в аминоеислотную последовательность.

В полицистронной мРНК прокариот между кодирующими участками имеются межцистронные области, варьирующие по размерам (рис. 2.56).

img60

Рис. 2.56. Полицистронная матричная РНК прокариот. 1 – некодирующие области; 2 – межцистонные области; 3 – кодирующие области; 4 – терминирующие кодоны.

В связи с тем, что прокариотические гены целиком состоят из нуклеотидных последовательностей, участвующих в кодировании информации, транскрибированные с них РНК сразу после их синтеза способны выполнять функцию матриц для трансляции. Лишь в исключительных случаях требуется их предварительное созревание – процессинг – т.е. совокупность реакций, ведущих к превращению первичных продуктов транскрипции в функциональные молекулы мРНК.

2.6.5.1.2. Особенности трансляции у прокариот

В прокариотических клетках процесс трансляции происходит практически одновременно с синтезом мРНК. Это связано с недолговечностью бактериальной мРНК, которая достаточно быстро подвергается распаду. Пространственная и временная сопряжённость транскрипции и трансляции у бактерий проявляется в согласованности скоростей этих процессов. При 37°С транскрипция идет со скоростью 14 кодонов/с, а трансляция – со скоростью 15 аминокислот/с.

Трансляция у прокариот начинается вскоре после образования 5'-конца мРНК, раньше, чем заканчивается полный ее синтез. В результате вслед за РНК-полимеразой по мРНК движутся рибосомы, осуществляющие сборку пептидных цепей (рис. 2.57). Через некоторое время (»1 мин) после начала транскрипции и ещё до завершения трансляции 3'-конца матрицы начинается деградация ее 5'-конца. Время жизни разных мРНК различно. Поэтому и количество рибосом, считывающих информацию с короткоживущих и долгоживущих мРНК, будет разным. Следовательно, количество белка, синтезированного на разных матрицах, также будет неодинаковым.

img61

Рис. 2.57. Транскрипция, трансляция и деградация мРНК у прокариот.
А – РНК-полимераза связывается с ДНК и начинает синтезировать мРНК в направлении 5′→3′;
Б – по мере продвижения РНК-полимеразы к 5′-концу матричной РНК к мРНК прикрепляются рибосомы, начинающие синтез белка;
В – группа рибосом следует за РНК-полимеразой, на 5′ конце мРНК начинается её деградация;
Г – процесс деградации протекает медленнее, чем транскрипция и трансляция;
Д – после окончания транскрипции мРНК освобождается от ДНК, на ней продолжается трансляция и деградацияна 5′-конце.

Трансляция у прокариот имеет интересную особенность. Первой аминокислотой в пептидных цепях является модифицированный метионин – формилметионин (дай две формулы для сравнения). С фомилметионина начинаются все вновь синтезированные пептиды. Даже в том случае, когда стартовым кодоном является кодон ГУГ, в обычных условиях кодирующий валин, в первом положении пептида всё равно оказывается формилметионин. Стартовый кодон АУГ или ГУГ следует за лидерным участком.

Соединение рибосомы с мРНК обусловлено комплементарным взаимодействием нуклеотидов одной из рРНК с нуклеотидной последовательностью лидерного участка мРНК. Эта последовательность (по имени описавших её исследователей её называют последовательностью Шайна–Дальгарно) располагается на расстоянии 4-7 оснований перед стартовым кодоном АУГ и обнаруживается повсеместно в лидерных участках у прокариот. При соединении 5'-конца мРНК с малой субчастицей рибосомы стартовый кодон обычно оказывается почти в середине экранированного рибосомой фрагмента мРНК, в области, соответствующей ее П-участку.

2.6.5.2. Транскрипция и трансляция в клетках эукариот

Генетический аппарат эукариот сложнее генетического аппарата прокариот. Поэтому количество наследственного материала у эукариот больше, чем у прокариот и расположен он в особых ядерных структурах – хромосомах. Хромосомы отделены от цитоплазмы ядерной оболочкой. По этой причине гены эукариот пространственно изолированы от аппарата и места синтеза белков, т.е. от рибосом, тРНК, аминокислот и ферментов, находящихся в цитоплазме клетки.

Кроме указанных различий в суммарном количестве ДНК и её организации в специальные внутриядерные структуры – хромосомы, у эукариот на каждом этапе реализации генетической информации обнаружены ещё и другие особенности.

2.6.5.2.1. Транскрипция у эукариот

В эукариотических клетках транскрипция осуществляется при участии трёх различных ядерных РНК-полимераз (РНК-полимеразы I, РНК-полимеразы II и РНК-полимеразы III). Кроме того, вне ядра транскрипция осуществляется РНК-полимеразой митохондрий и пластид.

РНК-полимераза I находится в ядрышках клеток. Она отвечает за транскрипцию генов рибосомальных РНК.

РНК-полимераза II локализована в ядерном соке и отвечает за синтез предшественников матричных РНК со структурных генов.

РНК-полимераза III находится в ядерном соке и осуществляет синтез малых рРНК и тРНК. Каждый из этих ферментов имеет две большие субъединицы и до 10 малых. РНК-полимеразы митохондрий и пластид по строению отличаются от ядерных.

Транскрипция у эукариот (также, как и у прокариот) начинается с обнаружения РНК-полимеразой промоторов. Промоторы эукариотических генов содержат по меньшей мере две специфические нуклеотидные последовательности, центры которых находятся в положении – 25 и – 75 пн от точки инициации транскрипции.

Первая из них расположена на расстоянии 19-27 нуклеотидов от стартовой точки против хода транскрипции и имеет среднестатистическую последовательность ТАТА(Т/А)А(Т/А). Её называют ТАТА-блоком, или (по имени открывшего её исследователя) блоком Хогнесса. В ТАТА-блоке (так же как в блоке Прибнова у прокариот), преобладают основания, образующие комплементарные пары с более слабыми связями. Это облегчает разделение ДНК на две однонитевые цепочки.

Вторая последовательность состоит из нуклеотидов ГГ(Ц/Т)ЦААТЦТ. Её обозначают как ЦААТ-блок. Эта последовательность встречается во многих промоторах эукариот. Она занимает положение между –70 и –80 нуклеотидами и также является областью, узнаваемой РНК-полимеразой.

Заканчивается транскрипция в участках, которые также как и у прокариот, называются терминаторами. Терминаторные участки эукариотических генов изучены слабее, чем у прокариот. Образования шпилек, участвующих в терминации транскрипции у прокариот, у эукариот не обнаружено. Поэтому, каким образом осуществляется у них терминация транскрипции, пока остается неясным. Предполагают, что решающим моментом в терминации транскрипции у эукариот является распознавание последовательности УУУУ, находящейся в области, богатой Г-Ц-парами Эта область, очевидно, играет определенную роль в остановке РНК-полимеразы, так как содержит пары, соединенные тройными водородными связями, труднее разделяемые на одноцепочечные фрагменты.

2.6.5.2.2. Особенности транскрипции генов у эукариот

img62

Рис. 2.58. Обобщённая схема передачи генетической информации в эукариотической клетке [Албертс Б. и др., 1986].

Структура генов эукариот существенно отличается от структуры генов прокариотических клеток. В отличие от непрерывных прокариотических генов большинство генов эукариотических клеток прерывисты. Обусловлено это тем, что в генах эукариот нуклеотидные последовательности, несущие информацию о составе аминокислот в полипептиде (или нуклеотидов в рРНК и тРНК) разделены нуклеотидными последовательностями, которые не используются при синтезе пептидов, транспортных РНК или рибосомальных РНК. Нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности аминокислот в белках (или нуклеотидов в тРНК и рРНК) называют экзонами. Неинформативные нуклеотидные последовательности называют интронами. Интроны не участвующие в кодировании информации о структуре белков, транспортных и рибосомальных РНК.

Количество интронов в разных эукариотических генах может быть различным – от 0 до нескольких десятков. Следовательно, количество экзонов в разных эукариотических генах различно. Например, ген овальбумина кур включает 7 интронов, а ген проколлагена млекопитающих – 50. Длина интронов в разных генах тоже варьирует – от 100 до 10 000 нуклеотидов и более. В некоторых генах на долю интронов может приходиться до 80% всех нуклеотидов.

По причине прерывистого строения эукариотических генов их первичные транскрипты, синтезированные РНК-полимеразой II, обладают большими, чем необходимо для трансляции, размерами. Объясняется это тем, что эти первичные транскрипты содержат копии и экзонов, и интронов. Вся совокупность этих копий образует так называемую проРНК или гетерогенную ядерную РНК (гяРНК). (Последний термин часто используют в сокращённой форме – гетероядерная РНК). Прежде чем выйти из ядра и начать активно функционировать в цитоплазме гяРНК претерпевает ряд изменений, в результате которых они превращаются в зрелые мРНК. Интронные участки с помощью специальных ферментов удаляются из гяРНК (рис. 2.58 и 2.59), а экзоны соединяются в единую молекулу мРНК, готовую к трансляции. Соединение экзонов в зрелую молекулу мРНК называется сплайсингом. Интронные участки, вырезанные из гяРНК расщепляются ферментами. Вся совокупность процессов превращения гяРНК в форму, пригодную для синтеза белка называется процессингом (созреванием) РНК. Пригодную для трансляции молекула мРНК называют зрелой мРНК. Таким образом процессинг матричной РНК включает в себя и вырезание интронов из гяРНК, и сплайсинг экзонов.

Модифицирование эукариотической гяРНК начинается вскоре после синтеза её 5'-конца, содержащего одно из пуриновых оснований (аденин или гуанин). К первому нуклеотиду на 5'-конце присоединяется трифосфонуклеозид, содержащий азотистое основание гуанин, связью 5'–5'. В результате образуется последовательность ГфффАфNф, в которой остаток гуанина находится в обратной ориентации по отношению к другим нуклеотидам мРНК (рис. 2.59). Затем присоединенный гуанин и первые 2-3 основания гяРНК метилируются. Этот участок будущей мРНК называется кэпом (колпачком), а сам процесс образования кэпа – кэпированием. Кроме метилирования кэпов при формировании мРНК происходит метилирование небольшой части внутренних нуклеотидов в молекуле. Метилированию подвергается приблизительно одно основание из каждой тысячи внутренних нуклеотидов мРНК.

Образуемые на 5'-концах матричной РНК кэпы обеспечивают узнавание молекул мРНК малыми субчастицами рибосом в цитоплазме. Ещё раз подчеркнём, что кэпирование мРНК осуществляется еще до окончания синтеза первичного транскрипта (гяРНК).

После того как транскрипция гяРНК закончится, на 3'-конце первичного транскрипта специальные ферменты отрезают некоторое количество нуклеотидов. Затем к оставшейся молекуле гяРНК присоединяется последовательность нуклеотидов, состоящая из 100–200 остатков адениловой кислоты (полиА) (рис. 2.59). Этот процесс называют полиаденилированием. Считают, что полиА-последовательность повышает стабильность мРНК и способствует последующему процессингу и транспорту зрелой мРНК из ядра. Благодаря кэпированию, метилированию и полиаденилированию мРНК зрелые эукариотические мРНК оказываются более стабильными по сравнению с прокариотическими мРНК.

img63

Рис. 2.59. Образование зрелой мРНК эукариот в ходе процессинга.
1 – некодирующие последовательности; 2 – экзоны; 3 – интроны; 4 – кодон-терминатор.

Кэп на 5'-конце и полиА-последовательности на 3'-конце образуются во время процессинга только у тех мРНК, которые синтезирует РНК-полимераза II. Однако около трети молекул мРНК, синтезируемых этим ферментом, вообще не содержат полиА-участка. К ним относятся, например, гистоновые мРНК (т.е. мРНК, с которых транслируются гистоновые белки).

После выхода мРНК в цитоплазму ее полиА-последовательность постепенно укорачивается под действием ферментов, отщепляющих нуклеотиды на 3'-конце. Следовательно, по длине полиА-последовательности на на 3'-конце мРНК можно косвенно судить о времени её пребывания в цитоплазме.

Вырезание интронов ферментами и сплайсинг экзонов должны осуществляться очень точно. Если интрон будет вырезан неточно может произойти сдвиг рамки считывания при трансляции и синтез аномального пептида. Точное вырезание интронов происходит потому, что на их концах есть специфические нуклеотидные последовательности. Они служат сигналами для разрезания гяРНК специальными ферментами. Эти ферменты узнают концевые участки интронов, разрывают фосфодиэфирные связей на границе экзон – интрон, а затем образуют связь между двумя экзонами. Полагают, что существуют и другие механизмы точного процессинга мРНК, в том числе и автокаталитическая способность РНК-транскрипта к сплайсингу.

В сплайсинге принимают участи особые малые ядерные РНК (мяРНК) находящиеся в комплексе с белками (мяРНП). Своими нуклеотидными последовательностями мяРНК комплементарно взаимодействуют с концевыми участками интронов. При этом интроны образуют замкнутые петли. Расщепление РНК в устье интронной петли приводит к удалению неинформативной последовательности и соединению (сплайсингу) сближенных концов зкзонов (рис. 2.59).

2.6.5.2.3. Трансляция у эукариот

У эукариот трансляция происходит в цитоплазме. Необходимые для синтеза белка зрелые матричные РНК перемещаются из ядра через ядерные поры в цитоплазму. Малые субчастицы рибосом в цитоплазме распознают 5'-конец мРНК. Затем происходит комлементарное взаимодействие лидирующей последовательности мРНК (содержащей до 100 нуклеотидов), с РНК рибосомы. При этом стартовый кодон АУГ оказывается в недостроенном П-участке рибосомы. К этому стартовому кодону присоединяется аминоацил-тРНК, несущая метионин. Затем к малой субъединице рибосомы присоединяется большая субъединица рибосомы и формируются ее А- и П-участки. Далее следуют многочисленные циклы элонгации полипептидной цепи. Поскольку в эукариотических клетках все мРНК являются моноцистронными, то с каждой мРНК транслируется одна полипептидная цепь. Синтез белка в эукариотической клетке заканчивается после прохождения рибосомой по всей мРНК и распознавания ею кодона-терминатора. При этом с кодоном-терминатором связывается специальныё белок – фактор терминации, который прекращает синтез пептидной цепи.

После синтеза большинство белковых молекул претерпевают ряд химических и конформационных преобразований, и лишь только после этого становятся функционально активными.

Синтезированные пептидные цепи на основе своей первичной структуры приобретают вторичную и третичную структуры. Многие белки приобретают ещё и четвертичную структуру, образуемую несколькими пептидными цепями.

В зависимости от функций, выполняемых белками, их аминокислотные последовательности могут претерпевать различные преобразования, формируя функционально активные молекулы белка. Многие мембранные белки синтезируются в виде пре-белков, имеющих на N-конце лидерную последовательность аминокислот. Эта лидерная последовательность аминокислот в белке обеспечивает ему узнавание мембраны. При встраивании белка в мембрану лидерная последовательность отщепляется. Секреторные белки также имеют на N-конце лидерную последовательность. В этом случае лидерная последовательность аминокислот обеспечивает транспорт белка через мембрану.

Некоторые белки сразу после трансляции несут дополнительные аминокислотные про-последовательности. Про-последовательности определяют стабильность предшественников активных белков. При созревании белка они удаляются. В результате удаления про-последовательности неактивный пробелок превращается в активный белок. Например, инсулин синтезируется как пре-проинсулин. Во время его секреции из клетки пре-последовательность отщепляется. Затем проинсулин подвергается модификации, при которой из него удаляется часть цепи и он превращается в зрелый инсулин.

Таким образом, в ходе посттрансляционных преобразований белки приобретают третичную и четвертичную структуры. Приобретая окончательную структуру, белки становятся функционально активными. Они включаются в клеточные структуры и осуществляют ферментативные и другие функции.

2.6.5.3. Центральная догма молекулярной биологии

Кодирование и расшифровка генетической информации у прокариот и эукариот обнаруживают принципиальное сходство. Это доказывает, что механизм экспрессии генов, связанный с транскрипцией и последующей трансляцией информации, сложился ещё до того, как были сформированы про- и эукариотический типы клеточной организации. Позже, в процессе дивергентной эволюции про- и эукариот сформировались различия в организации их геномов и экспрессии генов.

В первой половине ХХ века ген рассматривали как единицу наследственного материала, обеспечивающую развитие определенного признака организма. Однако как функционирует ген, оставалось неясным.

В 1941 г. Дж. Бидл и Э. Тэйтум (рис. 1.20, 1.21) сформулировали гипотезу, суть которой была выражена формулой «один ген – один фермент». Согласно этой гипотезе, каждая стадия метаболического процесса, приводящая к образованию в клетке какого-то продукта, катализируется белком-ферментом, за синтез которого отвечает один ген. Позднее было обнаружено, что многие белки имеют четвертичную структуру, в образовании которой принимают участие разные пептидные цепи. Например, гемоглобин взрослого человека включает четыре глобиновых цепи – две α- и две β-цепи, кодируемые двумя разными генами. Поэтому формула, отражающая связь между геном и признаком, была сформулирована более точно: «Один ген – один полипептид».

Таким образом, первичная структура полипептида определяет его вторичную, третичную и четвертичную структуры и, следовательно функциональную активность. Следовательно, первичная структура полипептида является элементарным признаком.

img64

Рис. 2.60. Общая схема передачи генетической информации от ДНК через РНК к специфическим полипептидам (белкам) [ Вилли К., Детье В., 1974., с.136].

В 1958 г. Ф. Крик процессы транскрипции и трансляции, идущие в эукариотической клетке при синтезе белков назвал центральной догмой молекулярной биологии. Схематически её содержание можно изобразить следующим образом (рис. 2.60).

Итак, центральная догма молекулярной биологии – это установленное в результате фундаментальных исследований основное положение теории наследственности. Согласно этому положению поток генетической информации идёт однонаправлено по пути: репликация ДНК→ транскрипция РНК→ трансляция белка. Более подробно суть центральной догмы можно выразить следующим образом: ген представляет собой фрагмент молекулы ДНК, транскрибируемый в виде молекулы РНК, которая либо транслируется в аминокислотную последовательность пептида, либо имеет самостоятельное значение в виде тРНК и рРНК. Согласно догме процессы транскрипции и трансляции не могут идти в обратном направлении: полипептид не способен транскрибировать молекулы мРНК, а молекула мРНК не способна транскрибировать молекулу ДНК. Синтезированные в клетке белки либо идут на построение клеточных органоидов, либо участвуют в катализе или ингибировании различных ферментативных реакций, в том числе – в регуляции транскрипции и трансляции.

Центральная догма отражает основные закономерности кодирования и реализации наследственной информации. Однако позже были обнаружены исключения – у некоторых вирусов установлена транскрипция молекул ДНК с молекул РНК с помощью специального фермента – обратной транскриптазы [Дубинин Н.П., 1986, с. 199, 495]. После открытия и детального исследования явления обратной транскрипции центральную догму биологии изображают следующей схемой:

img65

2.7. Нарушение антибиотиками процесса реализации генетической информации

Случаи подавления развития одного микроорганизма другим были хорошо известны еще в XIX веке. Тогда же это явление было названо антибиозом. Однако термин «антибиотик» был предложен американским микробиологом З.А. Ваксманом (рис. 2.61) лишь в 1942 г. Обширные биохимические и терапевтические исследования антибиотиков, а затем использование в медицинской и ветеринарной практике началось после второй мировой войны.

Антибиотики – это природные вещества и продукты их химической модификации, способные в низких концентрациях (10–3–102 мкг/мл) избирательно подавлять развитие бактерий, низших грибов, простейших, вирусов или клеток злокачественных опухолей [Овчинников Ю.А., 1987, с. 722]. Антибиотические вещества образуются микроорганизмами: актиномицетами, плесневыми грибами, бактериями, а также растениями и животными. Антибиотики могут выделяться клетками в окружающую среду или накапливаться внутри клеток и освобождаться при их разрушении. Некоторые антибиотики (например, хлорамфеникол) получают химическим путём.

Первый антибиотик – пенициллин открыл в 1928 г. британский ученый А. Флеминг. Он обнаружил, что плесневый гриб Penicillium notatum вызывает лизис (растворение) колоний стафилококков. Однако этот пенициллин оказался очень неустойчивым и продуцировался грибом в незначительных количествах. Поэтому в течение 10 лет после открытия антибиотика прогресс в изучении пенициллина был медленным.

img66

Рис. 2.61. Ваксман З.А. (1887-1973). Американский микробиолог и химик. Родился в России. Закончил Рутгерсский университет (1915, США). С 1949 г. – директор Института микробиологии при этом университете. Открыл и получил в чистом виде многие антибиотики. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине 1952 г. [Овчинников Ю.А., 1987, с. 723].

Вторая мировая война стимулировала поиски безопасного антибактериального вещества для обработки глубоких ран и заставила ускорить эти исследования. В 1940 г. британские исследователи X. Флори и Э. Чейн получили высокоактивный препарат пенициллина и провели его широкие клинические испытания. Позднее в результате объединенных усилий 39 лабораторий Великобритании и США были обнаружены в 1000 раз более производительные штаммы Р. notatum и Р. chrysogenum (рис. 2.62), разработаны методы их выращивания, а также выделения и медицинского применения пенициллинов.

Большой вклад в изучение антибиотиков внес З.А. Ваксман. Он выделил и очистил такие важнейшие антибиотики, как актиномицин и стрептомицин, а также разработал методы скрининга и испытания антибиотиков. В 1948-1950 гг. были открыты хлорамфеникол и тетрациклины, в 1952-1954 гг. – ряд полиеновых и все основные макролидные антибиотики. В 60-х годах ХХ в. стали известны почти все типы основных антибиотиков. В 1950 г. их было известно около 150, к 1960 г. – около 1200 и к 1970 г. – более 2000. В настоящее время за год описывается более 50 новых веществ. Сейчас в медицине широко используется около 100 антибиотиков. Основную долю среди них продолжают составлять пенициллины и цефалоспорины.

img67

Рис. 2.62. Колонии пенициллов, Penicillium notatun (слева) и P. chrisogenium (справа) на твёрдой питательной среде в чашке Петри.

Применение антибиотиков в медицине привело к практически полному искоренению губительных эпидемий и пандемий (например, чумы или холеры), сильно снизило смертность при хирургических вмешательствах, родах, а также инфекционных заболеваниях.

По механизму действия антибиотики можно разделить на 4 основных типа:

– ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот;

– ингибиторы матричного (рибосомального) синтеза белка;

– ингибиторы синтеза бактериальной клеточной стенки;

– ингибиторы функционирования цитоплазматической мембраны. Ниже будут кратко рассмотрены две первые группы антибиотиков [Мецлер Д., 1980; Мусил Я., 1981; Овчинников Ю.А., 1987].

2.7.1. Антибиотики ингибирующие синтез нуклеиновых кислот

Ансамакролиды. У этой группы антибиотиков биологическая активность связана с подавлением биосинтеза нуклеиновых кислот.

Характерной чертой химического строения ансамакролидов является наличие алифатической лактамной цепи, которая, как ручка корзины (от лат. ansa – ручка), связывает два несмежных положения нафталинового или бензольного кольца (рис. 2.63). Наиболее важные представители первой, нафталиновой группы – рифамицины В и SV и рифампицин. Во вторую (бензольную) группу входят гельданамицин из Streptomyces hydroscopicus и макбецин I из Nocardia sp. Первые рифамицины получены в Италии в 1959 г., а их структурное изучение завершено в 1973.

img68

Рис. 2.63. Химические формулы некоторых ансамакролидов [Овчинников Ю.А., 1987, с. 741]

Ансамакролиды нафталиновой группы обладают высокой активностью против грамположительных бактерий и Mycobacterium tuberculosis, а рифампицин является в настоящее время наиболее эффективным антибиотиком для лечения туберкулеза. Гельданамицин и макбецин I подавляют рост бактерий, грибов и простейших. Бензольные ансамакролиды не проявляют избирательной токсичности в отношении бактерий, но являются перспективными лекарственными препаратами против злокачественных опухолей и простейших.

Механизм действия ансамакролидов уникален. Они подавляют активность ДНК-зависимых РНК-полимераз в клетках бактерий и совершенно не взаимодействуют с РНК-полимеразами млекопитающих. Конкретная мишень нафталиновых ансамакролидов – β-субъединицы РНК полимеразы. Антибиотик образуют с β-субъединицами очень прочные нековалентные комплексы, из-за чего нарушается образование второй и третьей фосфодиэфирных связей в РНК.

Актиномицины. Антибиотики этой группы ингибируют биосинтез нуклеиновых кислот. Изучение актиномицинов началось в 1940 г., когда З.А. Ваксман и Г. Вудруфф выделили из Streptomyces antibioticus первый актиномицин (А). В настоящее время промышленность выпускает более 20 антибиотических препаратов актиномицинов в виде смесей, в которых обычно все же преобладает один компонент. Они высокоактивны против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Однако большая токсичность препятствует их использованию в качестве антибактериальных агентов. Актиномицины ограниченно применяются только в химиотерапии опухолей.

Наибольший интерес представляет актиномицин D – специфический ингибитор ДНК-зависимого синтеза РНК (рис. 2.64).

img69

Рис. 2.64. Формула актиномицина D [Овчинников Ю.А., 1987, с. 743].

Этот антибиотик практически не влияет на инициацию синтеза РНК, но сильно замедляет элонгацию цепи. Свою активность актиномицин D проявляет в результате интеркаляции (встраивания) плоской гетероциклической (феноксазиновой) части молекулы между параллельными плоскостями двух пар нуклеотидов – Г-Ц и Ц-Г в малой бороздке за счет образования водородных связей. Стабильность образующегося комплекса увеличивают пептидные части антибиотика, которые располагаются в малой бороздке спирали на протяжении приблизительно 6 пар оснований (рис. 2.65).

img70

Рис. 2.65. Интеркаляция (встраивание) актиномицина D в молекуле ДНК [Овчинников Ю.А., 1987, с. 743].

Блеомицины (рис. 2.66). Клинически важные противоопухолевые антибиотики, продуцируемые стрептомицетами. Блеомицины вызывают интенсивный распад ДНК в результате одиночных и двойных ее разрывов. Такому распаду подвергаются ДНК вирусов, бактерий и клеток млекопитающих. На РНК блеомицины не действуют. Выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизм разрывания цепи ДНК блеомицинами. Наиболее привлекательная из них состоит в том, что антибиотики в присутствии некоторых катионов могут вызывать специфическую модификацию оснований, в частности тимина, что приводит затем к ферментативному гидролизу ДНК эндонуклеазами.

Стрептонигрин (рис. 2.67). Этот антибиотик широкого спектра действия из Streptomyces flocculus вызывает одиночные разрывы в ДНК. Механизм действия стрептонигрина состоит в том, что он восстанавливается НАДФ до гидрохинона и далее окисляется в семихинон кислородом воздуха с одновременным образованием супероксидных радикалов (+O-OŸ), которые и вызывают гибель клеток.

img71

Рис. 2.66. Формула блеомицина [Овчинников Ю.А., 1987, с. 747].

Рис. 2.67. Формула стрептонигрина [Овчинников Ю.А., 1987, с. 747].

img72

Митомицины А, В и С, а также порфиромицин (рис. 2.68) представляют собой комплекс противоопухолевых антибиотиков, продуцируемых несколькими видами Streptomyces. Впервые они обнаружены в 1956 г., а их строение определено в 1962-1976 гг. Митомицины проявляют большую активность против отдельных видов опухолей (например, лейкопении). Наиболее поразительной чертой химического строения митомицинов является присутствие в молекулах азиридинового цикла, редко встречающегося среди природных соединений. Мишенью действия митомицинов является ДНК – они быстро подавляют репликацию и вызывают разрушение существующей ДНК.

img73

Рис. 2.68. Формула митомицинов [Овчинников Ю.А., 1987, с. 747].

Интересно, что вирусная ДНК, в отличие от ДНК клеток хозяина, митомицинами почти не разрушается. Обязательным условием действия митомицинов является их предварительное восстановление с помощью НАДФ in vivo.

 

2.7.2. Антибиотики ингибирующие синтез полипептидной цепи

На синтез пептидной цепи могут влиять различные антибиотики. Описанный выше синтез белка дан в общем виде. Однако в разных типах клеток существуют значительные различия в структуре рибосом и специфичности белковых факторов, участвующих в синтезе белка. Поэтому возникают различия в ингибировании отдельными антибиотиками. Кроме того, каждый тип клетки имеет различную проницаемость для данного ингибитора, а это приводит к значительной разнице в их чувствительности к ингибированию. Следовательно, данные, полученные по ингибирующему действию отдельными антибиотиками, должны относиться только к данной клетке или виду организмов. По этой же причине результаты, полученные in vitro, нельзя непосредственно переносить на условия in vivo.

Многие известные антибиотики довольно специфично ингибируют разные стадии белкового синтеза.

Тетрациклины (рис. 2.69) нарушают связывание аминокислот и аминоацил-тРНК в А-участке рибосом.

Стрептомицин (рис. 2.70) ингибирует белковый синтез и на стадии инициации, и элонгацию пептидной цепи. Стрептомицин связывается с 30S субчастицами рибосом прокариотов и совсем не действует на рибосомы эукариотов. Его мишень – специфический рибосомальный белок S12. В результате взаимодействия стрептомицина с рибосомой происходит ингибирование инициации полипептидной цепи.

img74

Рис. 2.69. Формула тетрациклинов [Овчинников Ю.А., 1987].

Радикалы указаны ниже.


Название тетрациклинов Х R1 R2 R3 R4
Тетрациклин Н СН3 ОН Н NH2
Хлортетрациклин (ауреомицин) Сl СН3 ОН Н NH2
Окситетрациклин (террамицин) Н СН3 ОН ОН NH2
7 -Бромтетрациклин Вr СН3 ОН Н NH2
7 -Хлор-6 -деметилтетрациклин Сl Н ОН Н NH2
2 -Декарбоксамидо-2-ацетилтетрациклин Н СН3 ОН Н СН3
7 -Хлор-2-декарбоксамидо-2-ацетилтетрациклин Сl СН3 ОН Н СН3
5-Окси-2-декарбоксамидо-2-ацетилтетрациклин Н СН3 ОН ОН СН3

img75

Рис. 2.70. Структурная формула стрептомицина [Овчинников Ю.Ф., 1987, с.734].

Хлорамфеникол (рис. 2.71). Этот антибиотик впервые выделен из культуральной жидкости Streptomyces venezuelae в 1947 г. Хлорамфеникол оказался первым препаратом, активным против риккетсий. Он подавляет также многие грамотрицательные и некоторые грамположительные бактерии и эффективен при лечении брюшного тифа и инфекций, вызываемых Haemophilius influenzae, Klebsiella pneumoniae, спирохетами и сальмонеллами. Терапевтическое использование хлорамфеникола ограничивают аллергические реакции. Кроме того, известны редкие (1:20000) случаи нарушения хлорамфениколом эритропоэза в костном мозге у пациентов. В этих случаях высокие концентрации антибиотика в крови в течение 1-2 недель могут привести к смерти больного.

img76

Рис. 2.71. Хлорамфеникол

Хлорамфеникол связывается с большой рибосомальной субъединицей и ингибирует синтез пептидной связи (пептидилтрансферазу). Основная мишень действия хлорамфеникола – несколько белков (L16, L2, L27 и некоторые другие, локализованные в А и П участкахрибосомы. Связавшись с этими белками, хлорамфеникол препятствует взаимодействию последних трех нуклеотидов аминоацильного конца тРНК с рибосомой. Этим он подавляет пептидилтрансферазную активность рибосомы. Действие антибиотика на бактериальную рибосому (70S) обратимо. Причина избирательной токсичности заключается в неактивности по отношению к эукариотическим (80S) рибосомам. Однако, хлорамфеникол способен нарушать работу рибосом в хлоропластах растений и митохондриях животных. Это является одной из причин его токсичности для млекопитающих.

Эритромицин и его аналоги (рис. 2.72) продуцируются лучистыми грибами Streptomyces. Известно более 70 антибиотиков этой группы.

img77

Рис. 2.72. Структурные формулы эритромицинов. [Овчинников Ю.А., 1987].

Эритромицин связывается с большими субчастицами рибосом прокариот и совершенно не реагируют с 80S рибосомами эукариотов. Он взаимодействует с белком L15, который находится на П-участке рибосомы и подавляет пептидилтрансферазную активность белка L16. Вероятно, эритромицин препятствует правильному взаимодействию пептидил-тРНК с донорным участком тРНК, находящейся в А-участке рибосомы. Он обычно связывается с рибосомами, содержащими короткие пептиды или с рибосомами уже освободившимися от пептидов, и буквально «замораживает» полисомы, останавливая биосинтез белка.

Пуромицин среди ингибиторов рибосомального синтеза белка заслуживает особого внимания. Он выделен в 1952 г. из культуральной жидкости Streptomyces albo-niger.

Пуромицин активен против ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших, остриц, ленточных глистов и некоторых злокачественных опухолей. Были предприняты попытки использования его для лечения трипаносомоза, амебиаза и опухолей, но, по-видимому, он слишком токсичен для широкого клинического применения. Формула пуромицина показана на рис. 2.73. Он представляет собой 3′;-дезокси-3′;-амино-N-диметиладенозин, ацилированный по 3′;-аминогруппе остатком O-метилтирозина.

img78

Рис. 2.73. Молекулярная структура пуромицина. Обратите внимание на сходство с концевым участком молекулы аминоацил-тРНК.

Структурно пуромицин очень похож на концевой фрагмент аминоацил-тРНК, но, благодаря значительно меньшему объему, быстрее связывается с А-участком рибосомы. После ацилирования связанного пуромицина по аминогруппе пептидилтрансферазой образуется формилметионилпептидилпуромицин. Он, из-за отсутствия кодон-антикодонного взаимодействия, мгновенно отщепляется от рибосомы и, тем самым, прерывает синтез белка. Пуромицин одинаково (неизбирательно) действует на рибосомы про- и эукариотов. Этим объясняется его довольно высокая токсичность для высших организмов.

В настоящее время количество антибиотиков постоянно увеличивается. Учёные изучают пути их биосинтеза в клетках организмов-продуцентов и механизмы действия на патогенные клетки.

Приложение

2.8. Белковая наследственность [Звягина Е., 2001]

На рубеже второго и третьего тысячелетий открыта особая форма наследственности – белковая. Учёные обнаружили так называемые прионные белки, которые способны передавать информацию о своей пространственной форме от одного белка к другому без участия ДНК. Открытие белковой наследственности дает надежду на исцеление от неизлечимых сегодня болезней.

2.8.1. Прионные белки

Как и многие другие серьезные открытия, обнаружение белковой наследственности было подготовлено несколькими разнонаправленными сериями исследований. Ни один из коллективов ученых, совместными усилиями которых было сделано открытие, первоначально не ставил целью изучать механизм наследственности.

img79

Рис. 2.74. Американский биохимик Стэнли Прузинер обнаружил не известный ранее тип белковой инфекции - так называемую прионную, за что был удостоен в 1997 году Нобелевской премии.

Американский биохимик Стэнли Прузинер (рис. 2.74) обнаружил новый тип инфекции – прионную, за что получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1997 году. В конце 90-х годов прошлого столетия в Англии разразилась эпидемия коровьего бешенства. Через зараженное мясо болезнь могла передаваться человеку. Для прекращения эпидемии было уничтожено большое количество крупнорогатого скота. Белковые возбудители этой болезни, поражающие головной мозг и нервную систему, были названы прионами. Прионы являются возбудителями и некоторых других смертельных болезней, например, болезни Крейтцфельда-Якоба у человека, скрепи у овец.

Стэнли Прузинер обнаружил, что абсолютно одинаковые по химическому составу прионные белки могут находиться в двух разных пространственных формах. Разница между такими белками отчасти напоминает разницу между сырым и вареным белком обыкновенного куриного яйца. Если белок находится в «нормальной» форме, он хорошо растворяется и выполняет в организме свойственную ему функцию. Напротив, белок, находящийся в «аномальной» пространственной форме, образует нерастворимые агрегаты, слипается. У прионов было обнаружено важное и уникальное свойство. Оказалось, что «аномальный» белок, столкнувшись с «нормальным» белком, переводит его в свою, «аномальную», форму (рис. 2.75). Эта трансформация и является сутью прионного типа инфекции: «больной» белок заражает «здоровый», который начинает слипаться и, накапливаясь, заполняет клетки мозга, препятствуя их работе. Причины изначального появления в организме белка в «аномальной» форме пока не установлены. Обе формы белка кодируются одним геном, поэтому вполне вероятно, что на образование «аномальной» формы могут влиять внешние воздействия. (Например, есть гипотеза, что к появлению «аномального» приона в организме может привести высокая температура, перенесенная человеком). Обнаружение прионного типа инфекции стало первым шагом к открытию нового типа передачи наследственной информации.

Рис. 2.75. Структура «нормального» (слева) и «аномального» (справа) прионного белка.

Второе направление исследований, подготовившее открытие прионной инфекции, было связано с дрожжами. Дрожжи – очень удобный объект для молекулярно-генетических исследований. Во-первых, это связано с тем, что популяция дрожжей включает огромное количество одноклеточных микроорганизмов, поэтому можно регистрировать очень редкие явления. Во-вторых, дрожжи генетически хорошо изучены: известны структуры всех генов дрожжей. В-третьих, дрожжи в генетическом плане устроены практически так же, как человек. Почти все белки, которые есть у человека, есть и у дрожжей, более того, часто эти белки взаимозаменяемы. И, наконец, дрожжи быстро размножаются, поэтому опыты не требуют длительного времени. Один из основателей школы генетики дрожжей в России – Сергей Георгиевич Инге-Вечтомов.

В 1964 году С. Г. Инге-Вечтомов обнаружил у дрожжей ген SUP35. Примерно в это же время британский исследователь Брайан Кокс нашел у дрожжей наследуемый признак, обладающий рядом уникальных свойств, трудно объяснимых с точки зрения обычных представлений о генетических явлениях. Позже в лаборатории Инге-Вечтомова были получены свидетельства того, что этот признак зависит от гена SUP35. Аналогичные результаты были получены и другими учёными. Все данные свидетельствовали о том, что белок Sup35 может каким-то образом отвечать за проявление и наследование этого признака, причем это его свойство не связано с мутациями в гене SUP35.

Обнаруженное явление оставалось необъяснимым до последнего времени, когда широкий интерес к прионам навел исследователей на мысль о сходстве белка Sup35 с прионами млекопитающих. Такое сходство предполагало, что белок Sup35 может иметь разную пространственную укладку, причем, находясь в прионной («аномальной») форме, белок может «наводить» такую форму на молекулы этого же белка, находящиеся в «нормальном» состоянии (рис. 2.76). Американский ученый Рид Викнер выдвинул гипотезу, что дрожжи могут синтезировать белки, проявляющие прионные свойства. Викнер предположил, что и в том, и в другом случае мы имеем дело с одним и тем же явлением, а именно с прямой передачей информации от белка к белку.

Правда, Прузинер применительно к прионам говорил об «инфекции», но ведь никто не наблюдал передачи вещества от одной клетки к другой через межклеточное пространство (а именно в этом заключается суть инфекции).

Чтобы оценить смелость гипотезы Р. Викнера, надо вспомнить: вся современная генетика основывается на том, что наследственная информация передается через молекулы ДНК, которые могут удваиваться и передаваться потомству. Белки же синтезируются на основе информации, заложенной в ДНК. В свое время сенсацией явилось открытие обратной транскрипции: оказалось, что информация может передаваться из РНК в ДНК. Но то, что информация, передаваемая по наследству, не может быть заложена в белках, никогда не подвергалось сомнению (если не считать ошибочной теории Лысенко). Теперь же получалось, что признак может наследоваться без участия ДНК.

img80

Рис. 2.76. На микроскопических снимках - прионные белки, возбудители коровьего бешенства.

В июле 1996 года в журнале Европейской организации молекулярной биологии (ЕМВО Journal) была опубликована статья М.Д. Тер-Аванесяна и его сотрудников. В ней было показано, что белок Sup35 может образовывать агрегаты, подобные тем, которые создают прионы в «аномальной» форме. Уже в следующем месяце аналогичные результаты, полученные лабораторией С.Линдквист, были опубликованы в журнале «Science».

Теперь нужно было доказать, что информация о пространственной форме передается напрямую от белка к белку. В 1997 году группа Тер-Аванесяна нашла такое доказательство. Опыт был поставлен in vitro (т.е «в пробирке») в среде не содержащей ДНК. К белку Sup35 (на рисунке – в первой пробирке) добавляли некоторое количество белка, находящегося в «аномальной» пространственной форме. Через 3 часа весь белок оказывался в «аномальной» конформации. Небольшое количество вновь образованного «аномального» белка снова добавляли к «нормальному» и это вновь приводило к превращению в «аномальный» белок. Так повторялось много раз, пока доля исходного «аномального» белка из-за многократного разбавления не оказалась совершенно ничтожной (рис. 2.77). В результате этого эксперимента стало ясно: «аномальный» белок, образованный из «нормального», способен передавать свою пространственную форму другому, «нормальному», белку. Так был открыт новый механизм передачи наследственной информации – белковая наследственность.

img81

Рис. 2.77. Схема эксперимента по трансформации «нормального» белка в «аномальный».

Нужно отметить, что функция белка Sup35, работа с которым привела к открытию белковой наследственности, была генетикам неизвестна. Ученые не могли ответить, зачем он нужен в организме? Эта загадка была решена молекулярными генетиками.

В 1982 г. Л.Л. Киселев и его коллеги из Института молекулярной биологии Российской академии наук занимались биосинтезом белков. В 1990 году американский ученый Т. Каски опубликовал статью, в которой описал белок, участвующий, по его мнению, в окончании процесса синтеза полипептидных цепей. Однако этот белок был практически тождествен тому, структуру которого расшифровали российские ученые, но который, согласно их данным, участвовал не в окончании, а в инициации синтеза полипептидных цепей. Это противоречило здравому смыслу: два очень похожих белка не могут выполнять совершенно разные функции. Напрашивался вывод: Каски ошибся, его белок не заканчивал синтез, а участвовал в его инициации. В 1993 году Л.Л. Киселев и его коллеги опровергают работу Каски, и уже в следующем году сам Каски подтверждает, что его выводы были ошибочны.

Какой же белок в таком случае завершает синтез полипептидной цепи? Поисками этого белка занялись российские ученые. В 1994 году (как раз в то время, когда Рид Викнер выдвинул гипотезу о прионоподобных свойствах Sup35) наши исследователи опубликовали в журнале «Nature» структуру такого белка. Его назвали еRF1. Этот белок оказался весьма консервативным по структуре: у человека, лягушки и дрожжей его аминокислотная последовательность очень похожа (дрожжевой белок имеет свое имя – Sup45). Как только это выяснилось, стало очевидно, что другой дрожжевой белок, о котором уже шла речь, – Sup35 (дрожжевой прион) тоже может быть вовлечен в завершение синтеза полипептидной цепи. Действительно, в 1995 году группы Киселева и Инге-Вечтомова совместно с группой М.Филиппа из Реннского университета (Франция) открыли новую группу белков, получивших название еRF3. Среди них был и белок Sup35. Стало ясно, что Sup35 – это один из двух белков, определяющих окончание белкового синтеза у клеточных организмов. Чуть позже группа Киселева доказала, что белки еRF3/Sup35 обладают ферментативной активностью: расщепляют одно из ключевых соединений клетки – гуанозинтрифосфат (ГТФ). Открытие ферментативной активности дрожжевого приона Sup35 имеет большое значение, так как позволяет использовать биохимические методы для анализа прионных превращений, что ранее было невозможно.

2.8.2. Значение открытия белковой наследственности

Итак, на примере дрожжевого белка открыт новый принцип наследственной передачи признаков. «Белковая наследственность» – так назвали ученые свойство прионоподобных белков передавать информацию о своей пространственной форме без участия ДНК. Насколько широко распространено это явление? Прионоподобные белки уже обнаружены у некоторых грибов, возможно, в скором времени они будут найдены и у других организмов.

При белковой наследственности происходит передача информации иного типа по сравнению с той, что передается через гены, а именно передача структурной, трехмерной информации. Это совершенно новый принцип. Есть теория, что прионоподобные белки участвуют в формировании долговременной памяти человека. Если это действительно так, то белковая наследственность, возможно, связана с важнейшей функцией мозга.

Открытие белковой наследственности не означает пересмотра теории передачи наследственной информации через нуклеиновые кислоты. Это – дополнительная, новая глава генетики. Однако не исключено, что многие явления будут переосмыслены. Ученые не исключают, что таких белков много, и в таком случае белковый механизм наследственности может иметь большое значение в жизни организмов.

Возможно, белковая наследственность играла значительную роль и в биологической эволюции, по крайней мере, в эволюции одноклеточных организмов, размножающихся путем деления. Ведь благодаря постоянному делению в популяции в результате механизма прионной наследственности может возобладать одна из форм прионоподобного белка. Пока неясно функциональное назначение той или иной формы, но в природе нет ничего лишнего – следовательно, этот механизм для чего-то нужен. В случае дрожжей он, вероятно, служит для адаптации.

Для медицины открытие белковой наследственности означает перспективу лечения болезней, вызываемых прионными и прионоподобными белками. Что касается собственно прионных заболеваний, то они мало распространены среди людей (приблизительно один случай на миллион в год). Но у животных они нередки, а в связи с их инфекционностью опасность заражения человека очень велика – именно это обусловило усиленное внимание к эпидемии коровьего бешенства в Англии. Кроме того, есть еще ряд заболеваний – гораздо более распространенных, – которые также связаны с белками, способными образовывать агрегаты. Например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хангтингтона. Возможно, они также передаются с помощью механизма белковой наследственности. Уже открыт способ «лечения» дрожжей от прионных заболеваний. Следовательно, появилась модель, позволяющая разрабатывать лекарства для человека. Но в этом направлении предстоит ещё много исследований.

Дополнительный материал о прионных болезнях животных см. в методическом пособии [Черепахина Л.А., 2005, с. 14-22].

Задачи

[Беркинблит М.Б. и др., 1992; Богоявленский Ю.К. и др., 1988]

1. В гене, кодирующем определенный белок, произошла мутация. В результате в клетке перестал синтезироваться этот белок, но появился другой – более короткий, чем исходный (может быть – фрагмент исходного, хотя это не проверяли). Как мутация могла привести к такому эффекту? Может ли случиться, что в результате мутации вместо исходного белка станет синтезироваться более длинный?

2. Известно, что в составе нуклеиновой кислоты содержится нуклеотиды четырех типов; генетический код триплетный, т.е. каждую аминокислоту кодирует последовательнность из трех нуклеотидов.

а) Сколько всего может быть таких троек (кодонов) ?

б) Пусть нуклеотидов четыре, а кодон состоит из двух нуклеотидов (код диплетный). Сколько будет кодонов? А если код тетраплетный?

в) Если нуклеотидов 6, а код диплетный? Триплетный? Тетраплетный?

3. У цератозавров важную роль в жизненных процессах играет фермент цератаза, вырабатываемый желтой железой. На ранней стадии индивидуального развития в клетке, из потомков которой образуется желтая железа, обнаружены мутации в гене, кодирующем цератазу. У четырех разных эмбрионов в начале данного гена произошли разные мутации, указанные ниже. Структура мРНК, синтезированной с нормального гена (начиная с первого инициаторного АУГ -кодона):

→ АУГГГАУЦГ...

Структура РНК, синтезированных с мутантных генов:

1. → АУГГАУЦГ...

(Г выпадает)

2. → АУГГГАУАГ...

(Ц заменяется на А )

3. → АУГГГАУУГ...

(Ц заменяется на У)

4. → АУГГГАУЦЦ...

(Г заменяется на Ц )

Можно ли что-нибудь сказать о том, какая мутация принесет больше, а какая – меньше вреда?

4. В клетке произошла точечная мутация в одном гене (т.е. замена в одном месте бывшего там нуклеотида на другой – с соответствующим изменением в комплементарной цепи ДНК). В результате синтез белков обрывается на местах, где раньше включалась одна и та же аминокислота. Что это за мутация?

5. В некоторых книгах содержится утверждение, что пчелы могут путем изменений в пище направленно изменять генотип своего потомства. В качестве довода приводится факт, что в маточном молочке содержатся ДНК и РНК. Насколько, по Вашему мнению, этот аргумент убедителен? Ответ обоснуйте.

Таблица 2.9

Генетический код

Аминокислота Кодоны мРНК
Аланин ГЦУ, ГЦЦ, ГЦА, ГЦГ
Аргинин АГА, АГГ
Аргининовая кислота ЦГУ, ЦГЦ, ЦГА, ЦГГ
Аспарагин ААУ, ААЦ
Аспарагиновая кислота ГАУ, ГАЦ
Валин ГУУ, ГУЦ, ГУА, ГУГ
Гистидин ЦАУ, ЦАЦ
Глицин ЦАА, ЦАГ
Глутамин ГАА, ГАГ
Изолейцин ЦУА, ЦУГ, АУУ, АУЦ, АУА
Лейцин УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ
Лизин ААА, ААГ
Метионин АУГ
Пролин ЦЦУ, ЦЦЦ, ЦЦА, ЦЦГ
Серин УЦУ, УЦЦ, УЦА, УЦГ
Тирозин УАУ, УАЦ
Треонин АЦУ, АЦЦ, АЦА, АЦГ
Триптофан УГГ
Фенилаланин УУУ, УУЦ
Цистеин УГУ, УГЦ

Определение структуры ДНК по строению молекулы белка

6. Полипептидная цепь белка включает 20 аминокислот: глицин – изолейцин – валин – глутамин – глицин – цистеин – цистеин – серин – валин – цистеин – серин – лейцин – тирозин – глицин – лейцин – глутамин – аспарагин – тирозин – цистеин – аспарагин. Определите структуру участка молекулы ДНК, кодирующего эту полипептидную цепь. Состав кодонов, кодирующих аминокислоты, приведен в табл. 2.9.

7. Фрагмент молекулы белка миоглобина содержит аминокислоты, расположенные в следующем порядке: валин – аланин – глутаминовая кислота – тирозин – серин – глутамин. Напишите структуру участка молекулы ДНК, кодирующего эту последовательность аминокислот.

8. Фрагмент полипептидной цепи В инсулина ключает 8 аминокислот: глицин – изолейцин – валин – глутамин – глицин – цистеин – цистеин – аланин. Напишите порядок расположения и состав кодонов в молекуле ДНК на участке, кодирующем полипептидную цепь.

9. Начальный участок полипептидной цепи бактерии Е. coli состоит из 10 аминокислот, расположенных в следующем порядке: метионин – глицин – аргинин – тирозин – глутамин – серин – лейцин – фенилаланин – аланин – глицин. Какова последовательность нуклеотидов на участке ДНК, кодирующем полипептидную цепь?

Определение строения молекулы белка по структуре молекулы ДНК

10. Участок гена, кодирующего белок, состоит из последовательно расположенных нуклеотидов ААЦГАЦТАТЦАЦТАТАЦЦААЦГАА. Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи, закодированной в этом участке гена.

11. Участок гена, кодирующего одну из полипептидных цепей гемоглобина, состоит из кодонов следующего состава: АЦЦАТТГАЦЦАТГАА. Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

12. В результате мутации на участке гена, содержащем 6 триплетов: ААЦ – ГАЦ – АЦЦ – ГАА – ААА – ГАЦ, произошло замещение в третьем триплете: вместо гуанина обнаружен цитозин. Напишите состав аминокислот в полипептиде до мутации и после нее.

13. Фрагмент молекулы ДНК состоит из нуклеотидов, расположенных в последовательности: ТАААЦТГЦГАААТЦТГААГТЦ. Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи, закодированной в этом участке гена.

14. Фрагмент одной из цепей ДНК имеет следующую последовательность нуклеотидов: АААГАТЦАЦАТАТТТЦТГТТАЦТ. Напишите строение молекулы мРНК, образующейся в процессе транскрипции на этом участке молекулы ДНК.

15. Полипептид состоит из четырнадцати аминокислот, расположенных в следующей последовательности: глутамин – глицин – аспарагиновая кислота – пролин – тирозин – валин – пролин – валин – гистидин – фенилаланин – аспарагин – аланин – серин – валин. Определите структуру участка мРНК, кодирующего данный полипептид.

18. Какие изменения произойдут в строении белка, если в фрагменте молекулы мРНК, имеющем состав АУАГУЦАУГУУАЦУГ, произойдет замена нуклеотида в положении 7 на цитозин, а в положении 2 на аденин?

19. Участок молекулы ДНК состоит из следующих кодонов: ЦТЦ-ТТЦ-АТТ-ТАТ-ТЦЦ-ААЦ. Напишите структуру мРНК и первичную структуру белка, который кодирует этот отрезок молекулы ДНК.

20. Участок цепи ДНК, служащий матрицей для образования мРНК, включает следующие нуклеотиды:

ААЦАААЦТТАЦЦГТАГТТАГАГТГАЦАЦТТ.

Напишите, какие нуклеотиды будут использованы для построения мРНК на этом участке молекулы ДНК, если мРНК строится по принципу комплементарности.

21. Образовавшийся участок молекулы мРНК имеет следующий состав кодонов: ГЦГ - АЦА - УУУ - УЦГ - ЦГУ - АГУ - АГА - АУУ. Определите, какие кодоны ДНК будут кодировать эту мРНК и в какой последовательности они будут располагаться.

22. Участок одной цепи ДНК состоит из последовательности кодонов: ААГ - ГАА - ТАТ - АЦЦ - АТА-ЦГА - ГТА - ATT - TTT. Определите, какие кодоны войдут в состав мРНК, закодированной на этом участке и в каком порядке они будут располагаться.

Определение строения молекулы белка по структуре молекулы мРНК (и ДНК)

23. Фрагмент цепи мРНК состоит из последовательно расположенных кодонов: ГУГ-УУГ-УУЦ-УГГ-УУУ- АУА ~ АУЦ - УГА - УАА. Какие аминокислоты должны принести тРНК к месту синтеза белка, закодированного в этом участке мРНК, и какие антикодоны должны иметь тРНК?

24. Напишите первичную структуру белка, который строится на молекуле мРНК, имеющей следующий состав нуклеотидов:

АУЦГУУЦУЦУАААУАГУГУАУЦУУ.

25. Фрагмент молекулы белка состоит из следующих 8 аминокислот: валин – лейцин – серин – тирозин – пролин – аланин – аспарагин – валин. Сколько тРНК могли быть использованы клеткой для синтеза этого белка и почему?

26. Фрагмент цепи А инсулина состоит из 5 аминокислот: глицин – изолейцин – валин – глутамин – глутамин. Определите структуру участка мРНК, кодирующего этот участок инсулина.

27. У нормального гемоглобина А фрагмент β-цепи 4-й пептид состоит из 8 аминокислот: валин – гистидин – лейцин – треонин – пролин – глутаминовая кислота – глутаминовая кислота –лизин. У гемоглобина S в этом пептиде в положении 6 вместо глутаминовой кислоты стоит валин, а в гемоглобине L – глицин. Определите изменения на участке мРНК, кодирующем 4-й пептид гемоглобина S и G.

28. Фрагмент одной из полипептидных цепей фермента поджелудочной железы рибонуклеазы состоит из 10 аминокислот: глутамин – глицин – аспарагиновая кислота – пролин – тирозин – валин– пролин – валин – гистидин – фенилаланин. Определите структуру участка мРНК, кодирующего эту полипептидную цепь, и типы тРНК, участвующих в синтезе белка.

29. Фрагмент цепи А нормального гемоглобина состоит из 9 аминокислот, расположенных в следующем порядке: гистидин – валин – лейцин – лейцин – треонин – пролин – глутамин – глутамин – лизин. Какова структура мРНК, служащей матрицей для синтеза этого участка молекулы гемоглобина, и структура ДНК, кодирующей данную мРНК.

Действие антибиотиков

30. Антибиотик пенициллин убивает только делящиеся бактериальные клетки, но не действует на покоящиеся. Каким образом, используя этот антибиотик, можно отобрать мутантов, нуждающихся для своего роста а) в глюкозе, б) в Fe+2, в) в каком-то ином веществе?


 

Контрольные вопросы

Контрольные вопросы смотрите здесь.

Рекомендуемая литература

Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия. -М.: Мир. 2000. -469 с. Читать онлайн.

Ратнер В.А. Генетический код как система. // Соросовский образовательный журнал. 2000. Том 6. № 3. –С. 17-22. Читать онлайн.

Ушаков В.Ю. SOS-система репарации ДНК у бактерий (Обзор) // Вестник Пермского университета. 2010. № 2. -С. 19-30. Читать онлайн.

Черепахина Л.А. Медленные вирусные и прионные болезни животных. -Орёл: Изд-во ОрёлГАУ. 2005. -25 с. Читать онлайн.

Другую рекомендуемую литературу смотрите здесь

Цитаты

Материал для запоминания





Пока пользуйтесь pdf-файлом, ссылка на который дана в начале этой страницы.


Электронная версия этой главы публикуется по типографскому изданию:
Крюков В.И. Генетика. Часть 1. Введение в генетику. Молекулярные основы наследственности. –Орёл: Изд-во Орёл-ГАУ, 2006. –192 с. с илл. Решение о присвоении грифа УМО № 06-523 от 26.05.2006.
Скачать Скачать главу.

 

Содержание главы

 

Система Orphus

 

Обложка жунрнала

 

Это не генетика.
Но знать нужно.

 

Счётчик посещений RevolverMaps удалён по причине некорректной работы